分子诊断实验室核酸污染清除方法研究

王 哲，秦怡璠，王一萍，曾杰生

（1.广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院），广东 佛山 528311；2.佛山丁智生物科技有限公司，广东 佛山 528311）

2019 年12 月份新冠疫情发生后，疫情在全球的大流行对各国公共卫生和全球经济造成严重威胁，了解和遏制新冠病毒的环境传播模式对各国制定相关公共卫生政策至关重要［1］。早发现并进行流动性管控是快速控制新冠病毒传播的方法，新冠病毒核酸荧光定量 PCR 检测由于其高灵敏度和准确性成为公认的金标准［2］。

DNA 在生活和工作环境中普遍存在，人们说话、打喷嚏、咳嗽，即使戴着口罩也会引入 DNA，普通的污染途径包括通过离体唾液、灰尘及气溶胶等介质的传播方式，或是样本受到污染［3］。在分子实验室，造成假阳性的原因有多种，比如实验操作不规范［4］，实验室管理不当［5］，但更多的核酸污染是重复进行 PCR 扩增实验，扩增产物会在实验室环境中累积，一个 PCR 反应产物能产生多达109个拷贝的靶序列的 PCR 实验，如果产物被雾化，即便是最小的气溶胶体也会包含106个扩增产物以上，在短时间内，气溶胶产物扩散累积将污染整个实验室的试剂、耗材设备和通风系统［6］。一般利用紫外光照射和高压灭菌来处理实验耗材中的 DNA 污染，有实验证明，高压灭菌（128 ℃，420 min）后，再次干燥，暴露于10～60 J/cm2的紫外光照射下能够清除，但此方法耗费时间长并且紫外线透射度有限、高压灭菌对耗材有选择性等局限［7-8］。无菌医疗产品常用环氧乙烷（EO）气体来灭菌，通过 EO 处理 3 h可使 PCR 扩增的 DNA 减少 104个数量级，因此利用 EO 来阻止 DNA 扩增的方法是有效的，但是 EO并不能完全清除 DNA 污染，且作用后会有副产物遗留，导致这种方法难以在分子实验室应用［9-10］。因此，需要寻求一种更便捷的办法来预防或减少核酸污染。核酸清除剂是目前市面上商品化使用的专门清除核酸污染的试剂，针对性强、效果好且毒性小。核酸清除剂是通过产生活性氧自由基，达到对核酸片段氧化降解目的。本文采用了含有双氧水、抗坏血酸、酸碱缓冲液及起到催化作用的金属阳离子的核酸清除剂，分别测试了DNA 清除剂对长片段和PCR 产物的短片段的降解效果、对气溶胶的处理效果、对桌面仪器表面的处理效果来分析核酸的降解能力。

1 实验材料与方法

1.1 主要试剂和设备

1）主要试剂见表1。

表1 主要试剂及试剂品牌

2）主要设备见表2。

表2 主要仪器名称及品牌

1.2 实验步骤

1）配制DNA 清除剂。

配制1 L pH 为3 的0.2 mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。柠檬酸称取35.74 g，柠檬酸钠称取4.12g；取柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液900 mL，称取 L-抗坏血酸17.612 g 使其浓度达到0.1 mol/L，搅拌溶解；称取 CuSO4·5H2O 使其浓度达到0.02 mol/L；加30 % H2O26 mL，使其达到 0.000 1 mol/L；加EDTA 3.36 g，使其浓度达到0.01 mol/L；将整体溶液补足至1 L；置于 4 ℃ 保存备用。

2）DNA 提取。

将鼠伤寒沙门氏菌接种于 LB 培养基中，37 ℃、150 r/min 摇床培养 8 h，沙门氏菌各取 500 μL 菌液（108CFU/mL），根据 DNA 提取试剂盒说明书提取DNA，保存于 -20 ℃ 备用。

3）凝胶电泳。

使用琼脂糖凝胶电泳进行实验，配制 1.5 % 琼脂糖凝胶，使用 1 mm 齿梳。分别取沙门氏菌高分子量DNA 和扩增过后的低分子量 DNA 各 5 μL，与等体积的DNA 清除剂反应 20 min 后作为待测样品，高分子量 DNA 和低分子量 DNA 使用不同的 Marker，分开进行电泳。Marker 加样量为 6 μL，样品加样量为9 μL。电压 130 V，20 min。

4）样本采集。

选择 PCR 实验室污染严重的区域并对关键实验区域及仪器耗材进行采样。我们选择冰箱、离心机、桌面、门把手、超净工作台及移液枪 6 个区域，使用 PCR 级水浸湿棉签拭子，对目标区域进行旋转涂抹擦拭，6 个区域分别选择 1 个位点作为采样区域，将擦拭处理过的棉签溶于装有 500 μL PCR 级水的离心管中。对实验室环境使用DNA 清除剂进行彻底清洁，处理后以上述同样的方式进行取样。

5）DNA 清除剂对 PCR 的抑制效果测定。

向 PCR 反应体系中加入DNA 清除剂或取其稀释液 5 μL；将体系补足至 20 μL。DNA 清除剂稀释，按照 10 的倍数进行稀释，稀释 5 个级别。

6）DNA 清除剂降解效率测试。

取 5 个 EP 管，向管中加 10 μL DNA 样本，并编号 1～5，向 1、2 管中加双蒸水 20 μL，向 3～5 管中加 DNA 清除剂 20 μL，静置 20 min 后将 5 个孔中的试剂全部吸出，用 20 μL 双蒸水进行清洗，清洗两遍，取第二次的水为样本，进行 PCR 扩增。

7）PCR 反应。

准备沙门氏菌上游引物 invA-F（5’TGCGAGTGG TAAATTATTCCGAT3’）和 下 游 引 物 invA-R（5’GCCA GACAGTGGTAAAGCTC3’）进行PCR 产物扩增，以提取的沙门氏菌 DNA 为模板，反应体系为 20 μL，分别是：PCR Buffer 10 μL，10 μmol/L PCR 上下游引物各1 μL，模板 DNA 1 μL，补充水至 20 μL。扩增程序PCR 反应条件为 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1min，40 个循环。反应后的产物 -20 ℃保存备用。

本实验中 qPCR 的反应体系为 20 μL，分别是：PCR Buffer 10 μL，10 μmol/L PCR 引物各 1 μL，模板 DNA 5.5 μL，补充水至 20 μL。PCR 反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40 个循环。

2 实验结果

1）DNA 清除剂对长片段和短片段的降解。

经过 PCR 后，产物长度大约 200 bp，提取的核酸片段长度超过 10 000 bp。如图1 所示，（a）为DNA 清除剂作用于短核酸片段的实验，（b）为作用于长片段核酸的实验，其中泳道 1 为对照组，泳道 2为实验组。经过核酸清除处理后，对照组均有明显的条带，实验组完全看不出电泳条带，说明本文中的 DNA 清除剂具有较强的核酸降解能力。经分析，该试剂在反应过程中能够产生较多的羟基自由基，产生的羟基自由基能够与核酸片段快速结合，从而发生降解反应，从而达到降解效果。

图1 DNA 清除剂降解核酸后电泳图

2）DNA 清除剂对 PCR 的抑制作用。

将 DNA 清除剂稀释10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍、100 000 倍及以上进行实验，分别将稀释的清除剂与 DNA 模板进行等体积混合，取5 μL 作为模板进行 qPCR 扩增。

图2 为 DNA 清除剂对 PCR 扩增的抑制反应。其中曲线a 指未稀释的 DNA 清除剂检测结果，曲线b 指稀释 10 倍的 DNA 清除剂检测结果，曲线c 指稀释 100 倍及更大倍数 DNA 清除反应，曲线d 为未加DNA 清除剂。添加 DNA 清除剂的测试结果显示，高浓度的 DNA 清除剂对 PCR 反应具有明显的抑制作用，如图2 中曲线 a 和 b，当稀释到 100 倍以后，适当的浓度可能有助于 PCR 扩增，抑制作用不明显，如图2 中 c 组扩增曲线。与曲线d 对比，适当浓度的DNA 清除剂可能有助于PCR 扩增。

图2 DNA 清除剂对 PCR 扩增的抑制

3）DNA 清除剂清除效率。

在测试DNA 清除剂对核酸的降解效率中，处理组与对照组的Ct值出现明显的差异如图3。其中曲线A 为带有阈值线的扩增曲线，曲线B 为去掉阈值线的扩增曲线，a 为阴性对照，b 为阳性对照，c 为对照组第1 次处理取样，d 为对照组第 2 次清洗取样，e 为DNA 清除剂组第 2 次清洗取样，f 为DNA清除剂组第 1 次处理取样。实验中阳性对照可能是样本浓度过高造成扩增曲线异常，对比不设置阈值荧光曲线，确定阳性扩增曲线是可信的，如图3 所示。在双蒸水处理做为对照组实验数据中显示，第一处理的Ct（＜1）和第二次清洗取样的Ct（＞10），根据PCR 扩增模型，Ct值相差 3.32 浓度相差10 倍，说明第一次处理到第二次取样的稀释倍数大于1 000倍，即推测 DNA 清除剂处理组的稀释倍数也大于1 000 倍，根据 DNA 清除剂对 PCR 抑制试验数据分析，第二次清洗取样时，可以忽略残存 DNA 清除剂对 PCR 的扩增。

图3 DNA 清除剂对核酸的降解效率

实验结果显示，对照组的Ct分别是 9.65、9.69、10.08、10.15，平均值为 9.89；实验组的Ct值为 23.68、23.49、27.72、27.61、25.17、25.42，平均值 25.51。根据DNA 清除率η=（1-（1/2^（CtDNA清除剂-Ct水）））*100%计算本研究中的 DNA 清除剂的清除率为99.99%，清除效果明显。

4）DNA 清除剂对实验室处理效果测试。

对实验室的桌面、移液枪等取样，进行荧光定量 PCR 测试，得到结果图4，图4 为DNA 清除剂处理前后扩增曲线，A 为桌面，B 为移液枪，C 为离心机，D 为冰箱门，E 为门把手，F 为超净工作台。结果显示，核酸清除剂处理桌面、移液枪、离心机和门把手后，检测的Ct值均出现明显的增大，靶标浓度降低，说明核酸清除剂具有降解核酸的作用，对冰箱门和超净台处理前后的Ct变化较小，超净台内部属于相对干净的区域可能是前后Ct变化不大的原因，冰箱可能和接触的次数的多少和试剂处理相关，如图4 所示。

图4 DNA 清除剂处理前后扩增曲线

3 结论

随着核酸检测技术的成熟，各个高校、研究所、生物检测公司及医院等大部分都设有 PCR 实验室，PCR实验室非常容易发生污染，为防止出现假阳性或假阴性的结果，实验室一般都会规定相应的条款措施来预防，比如在实验室根据污染可能性合理划分实验区域、选择无菌实验耗材、选择质量较好的试剂盒进行实验、超净工作台或实验室经常进行紫外线照射、实验后的耗材垃圾按时清洁、部分耗材试剂进行高压灭菌［11］。本文提供了一种高效的DNA 清除剂，处理过的长片段和短片段核酸，均有效被降解，用其处理实验室的表面，检测后的Ct均降低，说明本研究中提供的 DNA 清除剂可以作为分子扩增实验室清洁剂使用。