骨髓间充质干细胞标记技术的研究与进展

朱杰

摘要：背景：骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究中常用的细胞，近来有关于其标记示踪技术的研究日益增多，研究的进展有目共睹但就其示踪方法的选择上仍存在较大争议。目的：对国内外 BMMSC的标记示踪技术的研究进展作一综述。方法：本文以“骨髓间充质干细胞、标记方法、示踪技术”等中文关键词在万方数据库和CNKI进行检索，并以“labeling，bone  marrow mesenchymal stem cell，Tracer”等英文关键词在 PubMed、Web of Science 数据库检索，选择文献进行综述。结果和结论：骨髓间充质干细胞有众多标记方法及示踪技术，主要有荧光染料标记法、荧光蛋白标记法、核苷酸标记法、核磁共振对比增强标记法等。不同的示踪方法有各自的优缺点，科研实验所选择的示踪方法应具有特异性强、灵敏度高、标记步骤简便、检测方法简单、对细胞或生物影响小等优点，而科研工作者也在不断改进更新示踪方法，骨髓间充质干细胞的示踪技术仍有待于进行进一步的研究。

关键词：骨髓间充质干细胞;标记方法;示踪技术;综述

【中图分类号】 G644.5 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）10--02

骨髓间充质干细胞是一种具有较强自我更新能力的多能干细胞，具有培养方便，提取简单，分化潜能高，免疫原性低1等优点故被广泛应用于组织工程，研究表明骨髓间充质干细胞移植入宿主体内可提高宿主缺失功能的再生修复程度2，随着骨髓间充质干细胞的研究日益增多，各类标记示踪技术层出不穷，寻找一种标记稳定且不影响细胞理化性质的标记方法能有效监测干细胞移植后的增殖分化情况。本文对几类常见的细胞标记技术作一综述。

1.荧光染料标记法

1.1 CM-DiL

DiL是一种可结合于细胞膜并在膜内通过被动扩散而标记细胞的亲脂性荧光染料，它还可以通过细胞的胞饮作用进入细胞来标记整个细胞质。其在细胞内消失周期较长，且较难由标记细胞转移到非标记细胞，细胞毒性低，对细胞活力及细胞生长影响较小3。 CM-Dil（氯苯甲酰氨-1，1’双十八烷基-3，3’，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐，Chloromethylbenzamido-1， 1-Dioctadecyl-3，3，3，3-TetramethylindocarbocyaninePerchlorate）是在Dil中加入了氯甲基取代物而成的Dil的衍生物，其通過与细胞内含巯基的多肽和蛋白结合而获得能够抵抗醛类的固定作用的能力，近年来已基本替代 Dil在细胞示踪方面的使用。CM-DIL是一种无毒的亲脂性膜染料，其染色稳定性和染色强度优于大多数其他荧光染料或放射性同位素4。其荧光激发波和发射波长分别为 553 nm、570 nm5。研究表明该染料标记能力强，且不影响间充质干细胞在体内外的迁移或多向分化潜能6，陈7等人的研究显示间充质干细胞经CM-Dil染色后传至第8代时仍有较强的荧光表达。CM-Dil不适用于细胞长期示踪是由于其标记细胞膜，有随着细胞分裂荧光强度也会逐渐降低的缺点。

1.2 CF-SE

羧基荧光素乙酰乙酸5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE）是一种非极性分子，具有很高的膜通透性而无荧光活性，当其进入细胞内环境后，其乙酸基团被细胞内的酶水解而转化为氨基反应性羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），后者带负电荷并具有很高的荧光活性，且细胞膜不再对其通透，其含有的succinimidyl ester基团能与细胞中的游离胺基结合形成稳定的具有绿色荧光的复合物存在于细胞中8，9。CFSE标记活细胞后可在细胞传代时将荧光标记物均匀地分配到子代细胞中，故分裂后细胞的荧光强度是亲代细胞一半，以此可用流式细胞仪在 488nm波长处进行分析，以此来推断细胞的传代情况。研究表明CFSE染色不影响角质形成细胞或黑素细胞的活性或正常迁移功能10。随着细胞的分裂增殖过程不断进行，细胞荧光染色活性也会随着细胞的分裂逐渐递减，故CFSE荧光染色法一般不用于细胞长期示踪。

1.3 DAPI

DAPI即4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（4’，6-diamidino-2-phenylindole）是较为常用的细胞核荧光染料，其能透过细胞膜进入细胞中并结合在DNA双螺旋上，故常用来标记活细胞。DAPI标记的优点是标记效率高，毒性小，费用低。缺点是由于DAPI是与DNA结合，DNA半保留复制的特点会使DAPI在子代细胞中的含量越来越低，此外，有研究表明死亡后的标记细胞释放出的DAPI可能被周围细胞摄取而出现假阳性11。Shang12等人的研究显示DAPI标记骨髓间充质干细胞后在紫外荧光激发下，标记细胞的细胞核呈蓝色，细胞膜及细胞质呈暗区，标记后的第3代细胞的荧光强度明显减弱且标记细胞存在活力逐渐降低的趋势。因此DAPI也适用于细胞的短期示踪。

2.分子学标记法

2.1荧光蛋白标记法

荧光蛋白标记技术是近来发展迅速的示踪技术，荧光蛋白即可自行发出不同颜色荧光的蛋白质，其中应用价值最大的是由 Shimomura13等在 1962年由维多利亚多管水母中提取而来的绿色荧光蛋白。GFP生色团结构被高能量光子照射后发生构象转变，由高能级构象跃迁为低能级构象后发出能量较低的光子14从而发出绿色荧光 ，GFP有着易于检测、灵敏度高、荧光性质稳定、无毒等优点，近年来成为被广泛应用的示踪物质。但是天然GFP荧光强度较低，故其通过氨基酸替换形成的突变体：增强型绿色荧光蛋白（EGFP）成为目前主要使用的荧光蛋白，该突变保留了GFP的诸多优点，使其荧光强度显著增强且更易于表达。Pinero 等用EGFP标记了BMSC后荧光稳定持续表达超过了60天。荧光蛋白标记的稳定高效使其被广泛应用于生物的研究中，但荧光蛋白标记法存在着费用高以及研究周期长的缺点。由于其荧光表达稳定且持续时间长，故更适用于一些长研究周期的示踪研究。

2.2核苷酸标记法

细胞增殖周期一共包括4个时期，DNA是细胞在S期利用各种原料以半保留复制的形式进行合成的，BrdU即5-溴脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）结构类似于胸腺嘧啶核苷酸，当细胞周期处于S期时且有BrdU存在于细胞中时，BrdU可竞争内源性胸腺嘧啶核苷酸的结合位点从而进入细胞的核酸中，后通过抗BrdU单克隆抗体对其进行免疫组织化学染色便可观察其标记细胞的情况。抗BrdU单克隆抗体不与细胞自身的胸腺嘧啶发生反应，避免了假阳性的情况出现。许伟等人的研究使用BrdU标记骨髓间充质干细胞，结果显示BrdU标记率为86.2%。BrdU标记的优点有：操作简便、标记迅速、标记率高。但有报道称未被标记细胞可吞噬死亡细胞所释放的BrdU从而出现假阳性标记。5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）是另一种胸腺嘧啶核苷类似物，但由于其损害细胞表型并降低细胞活力，故很少应用于干细胞示踪。

3.核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）对比增强剂标记法

1999年Weissleder提出分子影像学概念，分子影像学是通过不同的影像学技术显示不同分子水平下的特定分子，反映活体分子水平变化，在影像学方向研究其生物学行为的科学。主要包括磁共振成像、核医学成像和计算机断层成像等技术。由于核磁共振具有较高的时间和空间分辨率，加之近年来核磁共振对比剂研究的不断深入，故目前核磁共振对比增强剂标记法在骨髓间充质干细胞示踪研究中应用较广泛。该技术是用MRI追踪事先在体外被磁共振增强剂标记后并移植的细胞，目前应用较多的磁共振对比增强剂是超顺磁性氧化铁，起初其被用于标记淋巴细胞，主要用于一些有关免疫研究的示踪，现随着干细胞研究的进展被广泛应用于干细胞示踪中。SIPO具有超顺磁性、良好的生物相容性及稳定性，但直接标记干细胞时标记率低，因此需通过转染剂介导來提高标记率。周26等人应用多聚赖氨酸作为转染剂。其表面带大量正电荷，表面带负电荷的氧化铁微粒通过静电作用可与之充分结合而提高干细胞的磁标记率。Mishra的研究发现，PLL与SPIO联合标记间充质干细胞，可显著提高后者的横向弛豫率。SPIO标记细胞也有显著缺点：1.随着细胞分裂导致子代细胞内SPIO含量降低，进而影响观察效果。2.细胞死亡后SPIO又有被周围未被标记的细胞吞噬而产生假阳性的可能。3.高剂量SPIO标记细胞时会降低细胞活性。

结论

骨髓间充质干细胞分化潜能高，增殖能力强，目前被当作种子细胞广泛应用于组织修复及基因治疗中。其标记示踪技术众多且均具有一定的优缺点，所选用的标记方法应具有特异性强、灵敏度高、对细胞或生物影响小等优点。而科技工作者也在不断改进更新示踪方法，骨髓间充质干细胞的示踪技术仍有待于进行进一步的研究。

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