ＨＰＬＣ法测定丽江山慈菇中秋水仙碱含量

黄云先 刘云怀 杨光荣

【摘要】目的：建立高效液相色谱法（HPLC）测定丽江山慈菇中秋水仙碱的含量。方法：采用OmniGeneLLC生厂的HPLCColumnHubbleC18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱;以甲醇-水（60∶40）为流动相;检测波长为254nm;流速为1.0mL·min-1，柱温为30℃。结果：在建立的含量测定HPLC条件下，秋水仙碱在26.133～522.660μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，r=0.9997;平均回收率为99.91%，RSD=2.14%（n=9）。结论：本法简便、快捷，准确度高，专属性强，重复性好，可用于丽江山慈菇药材的含量测定及质量控制。

【关键词】丽江山慈菇;质量控制;高效液相色谱法;秋水仙碱;含量测定

【中图分类号】R284.1【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2022）11-0019-03

丽江山慈菇是百合科植物山慈菇IphigeniaindicaKunth的鳞茎[1]，又名山慈菇、土贝母、草贝母、假贝母、闹狗药[2]、苦子、光苦子、益辟坚[3]、光慈菇[4]如图1所示。云南省地方习用药材，为纳西族、白族、彝族常用药材。载于《本草遗拾》，为《云南省药品标准》（1974年版、1996年版）、《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药收载品种。与《中国药典》2015年版一部收载“山慈菇”比较，来源系不同科属植物，为与国家标准相区别，谓之“丽江山慈菇”，是云南产中成药的“乳癖清胶囊（国药准字Z20025068）”的原料药之一。丽江山慈菇还是提制秋水仙碱的主要原料。《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药中对丽江山慈菇的性状、鉴别、水分、酸不溶性灰分、浸出物有明确规定，但对其含量却没有测定方法，本文参照文献[5-6]，通过对云南省丽江古城区和玉龙县及大理4个批次的丽江山慈菇样品进行了秋水仙碱的含量测定，以建立一个合理的测定方法，从而达到控制丽江山慈菇药材质量的目的。

1仪器与试药

安捷伦1260型高效液相色谱仪[二极管阵列检测器，安捷伦（中国）科技有限公司];HubbleC18柱（250mm×4.6mm，5μm，OmniGeneLLC）;BT224S电子分析天平（德國塞多利斯）;MS205DU电子分析天平（梅特勒Pur）;elabFlex超纯水机（英国ELGE）。

秋水仙碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101176-201202，按93.6%计）;乙腈、甲醇[色谱纯，美国塞默飞世尔科技（中国）有限公司];磷酸（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）;水（实验室自制UP水，Ω=18.3）。丽江山慈菇样品购买、采集丽江古城区、玉龙县及大理样品共4个：L01，2015年8月，采自丽江市玉龙县龙蟠乡新文村，野生品，干燥花期全株;L02，2015年9月，采自丽江市古城区金山乡东河村，野生品，干燥果期全株;L03，2015年9月，购自丽江市古城区象山市场，为大理州鹤庆县野生品，干燥药材球茎;L04，2015年10月，购自丽江市玉龙县龙蟠乡新文村药农严四军，为其采挖的当地野生品，干燥药材球茎。

2方法与结果

2.1色谱柱与系统适用性试验谱柱：HubbleC18（250mm×4.6mm，5μm）;甲醇-水（60∶40）为流动相，流速为1.0mL·min-1，进样量为10μL，检测波长为254nm，柱温为30℃。理论板数按丽江山慈菇峰计不低于3000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液取秋水仙碱对照品适量，加甲醇稀释至刻度，制成每1mL含26.133μg的溶液，作为对照品液。色谱图如图2所示。

2.2.2供试品溶液取丽江山慈菇粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，称定重量。超声（500W，40kHz）处理30min，放冷，再次称定重量，用50%甲醇补足减失重量。滤过，滤液作为样品溶液。如图3所示。

2.3线性关系取秋水仙碱对照品13.96mg，精密称定，加甲醇制成每1mL含26.133、52.266、104.530、156.800、209.060、261.330、522.660μg的一系列的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定其峰面积，以对照品的浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，按外标法进行线性回归，线性方程为Y=42.65537X-149.68159，r=0.9997。说明秋水仙碱在26.133～522.660μg·mL-1浓度范围内线性良好。

2.4精密度试验取26.133μg·mL-1秋水仙碱对照品溶液10μL，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定其峰面积的RSD为0.3%（n=6），表明该系统的精密度良好。

2.5重复性试验取供试品溶液L01-1，按上述方法连续测定8次，测得峰面积RSD为0.6%（n=8），表明供试品溶液重复性较好。

2.6稳定性试验取供试品溶液L01-1，按含量测定方法测定9次，每次间隔约8h，测得峰面积的RSD为1.1%（n=9），表明供试品溶液在72h内稳定。

2.7回收率试验精密量取线性关系考察中储备液1mL至10mL量瓶中、3mL至25mL量瓶中1mL至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成含33.480、40.176、50.220μg·mL-1的对照品溶液。分别取以上3个浓度秋水仙碱对照品以1∶1的比例加入已知含量L01-1、L01-2、L01-3中，按前述色谱条件测定。回收率分别为96.7%，99.8%，102.3%，98.4%，98.7%，100.5%，99.3%，103.9%，99.6%，RSD=2.1%（n=9）。

2.8样品含量测定取26.133μg·mL-1的秋水仙碱对照品及各样品按“2.2.2”方法制备的供试品溶液，进行测定，按外标法计算丽江山慈菇中秋水仙碱的含量。同一样品平行测定2次，结果见表1。

3讨论

3.1检测波长的选定以二极管阵列检测器进行全波长190～400nm扫描，秋水仙碱对照品在254nm、353nm处有最大吸收，经试验确定采用254nm作为检测波长。理论板数按秋水仙碱峰计算不低于3000。

3.2流动相的选择筛选了乙腈-甲醇（40∶60）、甲醇-水（55∶45）（60∶40）（65∶35）、甲醇-0.2%磷酸溶液（60∶40）（40∶60）六組流动相进行考察，结果甲醇-水（60：40）分离效果好，峰形良好，且保留时间适中，故确定上述流动相系统为本法的流动相。

3.3样品提取溶剂选择取本品粉末（过四号筛）0.5g或1g，筛选了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇超声（500W，40kHz）处理30min、1h、2h或加热回流30min的方法分别进行样品提取，通过考察，取样品0.5g与1g，样品1g峰面积较好且稳定;加热回流30min与超声（500W，40kHz）处理30min结果相差不大;提取时间30min与1h、2h后，提取率几乎不变;使用50%的甲醇超声处理30min提取效率最高。故确定样品提取方法为取本品粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，称定重量。超声（500W，40kHz）处理30min，放冷，再次称定重量，用50%甲醇补足减失重量。滤过，滤液作为供试品溶液。此方法提取效率最高，且操作简便。

4结论

不同地区丽江山慈菇谱图略有不同，但秋水仙碱确实都存在，可见以秋水仙碱作为丽江山慈菇药材标识性成分有其合理性。且本法简便、快捷，准确度高，专属性强，重复性好，填补了以往丽江山慈菇含量测定的空白，可用于丽江山慈菇药材的含量测定及质量控制。经试验验证，新拟HPLC法可行。按实际测得含量值，建议定丽江山慈菇按干燥品计，含秋水仙碱（C22H25NO6）不得少于0.12%。

参考文献

[1]云南省食品药品监督管理局.云南省中药材标准（第二册，彝族药）[M].2005年版.昆明：云南出版集团公司云南科技出版社，2005：57.

[2]云南省药物研究所.云南天然药物图鉴（第二卷）[M].昆明：云南科技出版社，2004：225.

[3]王国强.全国中草药汇编（卷二）[M].3版.北京：人民卫生出版社，2014：543.

[4]有毒中草药大辞典编辑委员会.有毒中草药大辞典[M].天津：天津科技翻译出版公司，1991：265.

[5]国家药典委员会.中国药典（四部0502）[S].2020年版.北京：中国医药科技出版社，2020：57-58.

[6]钱斌，杨龙，李雪松，等.秋水仙碱的含量测定方法[J].中国药业，2009，18（6）：59.

（收稿日期：2021-10-11编辑：陶希睿）

作者简介：黄云先（1997-），女，汉族，本科，副主任药师，研究方向为食品药品检验检测，中成药、中药材（饮片）标准质量研究提高，药品质量评价性探究。E-mail：495659146@qq.com