基于网络药理学探讨固本止崩汤对功能失调性子宫出血的机制研究

曹一鸣 王悦竹 史亚婷 宫玮珩 刘雁峰

摘要 目的：運用网络药理学的方法探讨固本止崩汤对功能失调性子宫出血的可能性机制。方法：在中药系统药理学数据库与分析平台筛选固本止崩汤的活性成分并预测其潜在作用靶点，将获得靶点导入UNIPROT数据库进行基因的标准化处理;在GeneCards和OMIM数据库查找功能失调性子宫出血的相关靶点。运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，将二者交集靶点运用STRING平台分析蛋白间的相互作用关系。用DAVID数据库对交集靶点进行基因本体（GO）生物功能和富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并以图表形式展示。结果：以口服生物利用度（OB）和类药性（DL）2个筛选标准得到固本止崩汤中有效活性成分58个，得到靶点135个;在GeneCards和OMIM查找功能失调性子宫出血靶点共2 164个，韦恩图获得药物与疾病的交集靶点共85个，关键靶点涉及IL6、VEGFA、TP53、TNF、EGF等。以P富集分析得到GO条目135条，其中生物过程38条、分子功能36条、细胞组分61条，主要涉及对缺氧的反应、一氧化氮生物过程的正向调节、细胞外空间、细胞外区域、酶结合、类固醇结合等;KEGG富集分析得到25条通路（P<0.05，FDR<0，05），靶基因主要富集在癌症信号通路等信号通路中。结论：固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血具有多成分、多靶点、多通路的特点，其作用机制较为复杂，为后续的实验验证提供物质基础和理论依据。

关键词 网络药理学;中医;固本止崩汤;功能失调性子宫出血;靶点;分子机制;信号通路;富集分析

Study on the Mechanism of Guben Zhibeng Decoction in the Treatment of Dysfunctional Uterine Bleeding Based on Network Pharmacology

CAO Yiming，WANG Yuezhu，SHI Yating，GONG Weiheng，LIU Yanfeng

（Dongzhimen Hospital，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 101121，China）

Abstract Objective：To explore the possible molecular mechanism of Guben Zhibeng Decoction in the treatment of dysfunctional uterine bleeding by means of network pharmacology.Methods：The active components of Guben Zhibeng Decoction were screened on the platform of pharmacology database of traditional Chinese medicine system and their potential action targets were predicted，and then the obtained targets were imported into UNIPROT database for gene standardization treatment; the related targets of dysfunctional uterine bleeding was searched in GeneCards and OMIM databases.The network diagram of “drug-component-target-disease” was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software，and the interaction between proteins was analyzed by using STRING online platform.GO biological function and KEGG pathway enrichment were analyzed by DAVID database，and the results were displayed in graph form.Results：A total of 58 effective active ingredients in Guben Zhibeng Decoction were obtained by OB and DL screening criteria，and 135 targets were predicted.A total of 2 164 targets of dysfunctional uterine bleeding were found in GeneCards and OMIM，and 85 targets of intersection of drugs and diseases were found in Venn diagram.The key targets involved IL6，VEGFA，TP53，TNF，EGF，etc.A total of 135 GO items were obtained by P enrichment analysis，including 38 biological processes，36 molecular functions and 61 cellular components，mainly involving in hypoxia response，positive regulation of nitric oxide biosynthetic process，extracellular space，extracellular region，enzyme binding，steroid binding，etc.A total of 25 pathways were found by KEGG enrichment analysis（P<0.05，FDR<0.05），and the target genes were mainly enriched in cancer signal pathway etc.Conclusion：Guben Zhibeng Decoction has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-channel in the treatment of dysfunctional uterine bleeding，and its mechanism is complex，which provides material basis and theoretical basis for subsequent experimental verification.

Keywords Network pharmacology; Traditional Chinese Medicine; Guben Zhibentang; Dysfunctional uterine bleeding; Target; Molecular mechanism; Signal pathway; Enrichment analysis

中图分类号：R285.5;R271.12;R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.009

功能失调性子宫出血是青春期和绝经期发病率较高的妇科疾病[1]，患者主要表现为经血淋漓不盡、经期紊乱等症状[2]，严重影响患者的身心健康。功能失调性子宫出血多由于营养不良以及精神压力过大等因素诱发。目前在临床中多采用激素和刮宫治疗功能失调性子宫出血，激素疗法不良反应较大，且不适用于有迫切生育要求女性，刮宫疗法对患者子宫内膜的创伤较大，可能对患者的生育产生影响[3]。随着中医药的不断深入研究和发展，中药在治疗功能失调性子宫出血的疗效显著，可以有效调节患者的内分泌功能[4]，进而缓解患者的临床症状和促进月经周期的恢复。

固本止崩汤来源于《傅青主女科》，药物组成包括熟地黄、白术、黄芪、人参、当归、黑姜，具有补肾健脾、益气养血的功效[5]。其中，熟地黄具有滋阴补血之功效;白术和黄芪可以补气健脾、益气摄血，引离经之血归经;人参可以大补元气;当归具有调经止痛、补血活血之功效;黑姜可以温中止痛、温经散寒[6]。杨梅花[7]在观察固本止崩汤加减治疗98例无排卵性功能失调性子宫出血发现，固本止崩汤加减治疗功能失调性子宫出血可以提高血红蛋白指标，改善凝血功能，促使疾病的转归。邱嘉菡等[6]通过临床研究发现固本止崩汤能有效缩短凝血酶原时间，能够有效止血，因此能够有效治疗患者的功能失调性子宫出血。固本止崩汤在临床上被广泛应用于治疗患者的功能失调性子宫出血，但其作用机制尚不明确，因此本文运用网络药理学的方法探究固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的作用机制，以期为固本止崩汤的应用提供理论基础和依据。

网络药理学成功应用于“目标药物-疾病-基因”网络的构建和数据的可视化处理[8]，这有助于从多维度角度和分子机制探讨药物治疗疾病的作用机制。网络药理学可用于预测药物活性成分的靶点和相对应的靶向疾病途径[9]，因此越来越广泛地应用于预测药物的活性成分及潜在靶基因。本文运用网络药理学的方法，通过预测固本止崩汤的活性成分及潜在靶点，并构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，从分子水平上阐述了固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的潜在作用机制，为后续的实验验证提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 固本止崩汤活性成分收集 在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）分别检索熟地黄、白术、黄芪、人参、当归、黑姜的活性成分，以口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18为筛选标准，得到固本止崩汤的有效活性成分。通过TCMSP数据库预测所有活性成分的潜在靶点。

1.2 收集功能失调性子宫出血靶点 在OMIM和GeneCards数据库以“Dysfunctional uterine bleeding”为关键词进行检索，得到功能失调性子宫出血的疾病相关靶点。

1.3 韦恩图构建 借助Venn2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线平台将药物靶点与疾病靶点取交集，获得固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的关键靶点，以韦恩图展示。

1.4 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图 将固本止崩汤的活性成分及对应靶点、药物与疾病的映射靶点赋值后导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。利用软件中的“Network Analyzer”功能进行分析，并根据Degree值筛选出关键活性成分及靶点。其中节点代表药物、成分、靶点与疾病，边代表药物活性成分与靶点以及靶点与疾病之间的相互作用关系。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络核心靶点网络图构建 将药物与疾病的交集靶点上传至STRING（http：//string-db.org）在线数据库平台，并将物种设置为人（“Homo sapiens”），构建药物与疾病之间的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络图。将STRING数据库得到的数据信息导入至Cytoscape 3.7.2软件中，并以度值大于平均值为筛选标准，得到固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的核心靶点。

1.6 富集分析 将药物与疾病的交集靶点上传至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在线数据库平台，将物种设置为人（“Homo sapiens”），并将筛选条件设置为官方基因（Official Gene Symbol）。进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准，得到固本止崩汤对功能失调性子宫出血的生物功能注释，包括生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）3个部分，并进行数据的可视化处理;以同样的方法进行KEGG通路富集分析，得到固本止崩汤作用于功能失调性子宫出血的主要通路，并以表格形式展示。

2 结果

2.1 固本止崩汤活性成分筛选 在TCMSP数据库检索得到固本止崩汤所有药物活性成分，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选标准，得到固本止崩汤有效活性成分58个，其中熟地黄2个、白术7个、黄芪20个、人参22个、当归2个和炮姜5个;预测得到固本止崩汤靶点共139个。

2.2 药物与疾病靶点交集韦恩图 通过检索OMIM和GeneCards数据库，删除重复值后共得到疾病靶点2 164个，将固本止崩汤的潜在作用靶点映射到疾病靶点中，共得到85个交集靶点，制成韦恩图。见图1。

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络图 利用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图共有201个节点，其中药物活性成分51个、药物与疾病节点7个、靶点节点143个;其中红色代表白术活性成分、紫色代表熟地黄活性成分、蓝色代表靶点、浅蓝色代表黄芪活性成分、黄色代表人参活性成分、绿色代表药物与疾病名称，以及浅绿色代表炮姜活性成分，当归的活性成分β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）与人参中的活性成分重复，故图中未单独列出。根据Degree值筛选，其中豆甾醇（MOL000449）、β-谷甾醇（MOL000358）、山柰酚（MOL000442）、槲皮素（MOL000098）的度值分别为180、156、112、88，以上活性成分在药物治疗疾病过程中作用较为重要。见图2。

2.4 PPI网络图与核心靶点网络图构建及分析 将药物与疾病的交集靶点导入SRING数据库构建PPI网络图共有85个节点，927条边，平均节点数为21.8;其中节点代表靶蛋白，边代表靶蛋白质之间的相互作用关系。见图3。将STRING数据库得到的数据导入至Cytoscape 3.7.2软件中，以Degree>22为筛选条件，得到药物治疗疾病的核心靶点，其中Degree值排名前10的有白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）A、TP53、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）1、Jun激酶、表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）、雌激素受体（Estrogen Receptor，ESR）1、MAPK8，以上靶点在固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血起到关键作用。见图4。

2.5 GO功能结果分析 利用DAVID数据库对固本止崩汤作用于功能失调性子宫出血的有效作用靶点进行GO功能富集分析。以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准，得到135条GO条目，其中BP相关条目38条。主要涉及对缺氧的反应（Response to Hypoxia）、一氧化氮生物合成的正调节（Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process）等;CC相关条目36条，主要涉及细胞外空间（Extracellular Space）、细胞外区域（Extracellular Region）等;MF相关条目61条，主要涉及酶结合（Enzyme Binding）、类固醇结合（Steroid Binding）等。见图5～7。

2.6 KEGG结果分析 利用DAVID在线数据库对固本止崩汤作用于功能失调性子宫出血的有效作用靶点进行KEGG通路富集分析。以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准，取排名前20条通路，以表格形式展示。靶基因主要富集在癌症通路等信号通路上，固本止崩汤可能通过以上通路参与治疗功能失调性子宫出血。见表2。

3 讨论

功能失调性子宫出血在中医学上属于“崩漏”范畴，多是由于经血失调、冲任二脉受损所致[10]。脾肾亏虚，致阴阳失衡、气血失调，气不摄血，易导致崩漏。因此在治疗原则上应补肾健脾，固冲摄血。固本止崩汤具有补肾健脾、益气摄血的功效，且在临床中常用于治疗崩漏患者[5]，疗效较好。血为气之母，气有所依，气旺血生，现代研究表明，黄芪能够增强骨髓造血能力，改变血液流变学[11]，为各种贫血的治疗提供理论依据。肖晓玲[12]观察56例固本止崩汤治疗气虚型功能失调性患者，总有效率94.64%，说明固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血疗效显著，值得在临床中推广和应用。

通过筛选得到固本止崩汤中的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、人参皂苷、β-谷甾醇、山柰酚、异鼠李素等，说明以上活性成分可能是固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的物质基础。通常认为下丘脑-垂体-卵巢轴的调节机制失调是功能失调性子宫出血最主要的发病原因[13]，槲皮素可以降低下丘脑-垂体-卵巢轴中雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）α，ERβ和孕激素受体（Progesterone Receptor，PR）的表达，从而调节血清中促卵泡激素和黄体生成素水平的分泌[14]，促进卵巢功能和月经周期的恢复，减轻功能失调性子宫出血患者的临床症状。人参皂苷可以通过调节Bax/Bcl-2相关因子的表达，作用于子宫内膜上的孕激素受体，激发孕激素受体的活性[15]，从而控制出血。说明固本止崩汤可以通过多成分调节激素水平的分泌，促进卵巢功能的恢复，缓解功能失调性子宫出血患者的临床症状。

本研究通过构建PPI网络图，筛选得到固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的核心靶点主要有IL6、VEGFA、TP53、TNF、EGF、MAPK1、JUN、EGFR、ESR1、MAPK8等。TNF作为炎症介质之一，不仅能够抗肿瘤，还能够诱导卵细胞凋亡，损伤内皮细胞影响卵巢血供，进而影响激素的分泌[16]，导致经期紊乱和子宫出血，因此抑制TNF炎癥的激活可以有效减少出血量，抑制炎症反应和促进子宫内膜的修复[17]。EGF和VEGFA作为血管内皮生长因子，可以促进血管内皮细胞生长和血管新生[18]，并且可以修复创面，起到止血的作用[19]。ESR1作为雌激素受体靶点，可以有效改善患者的月经周期，促进子宫内膜修复[20]，减少子宫出血量。进一步说明固本止崩汤中治疗功能失调性子宫出血具有多成分、多靶点的特点。

GO生物过程治疗功能失调性子宫出血主要涉及对缺氧的反应、一氧化氮生物合成的正调节、细胞外空间、细胞外区域、酶结合、类固醇结合等。通过KEGG通路富集分析，靶基因主要富集在癌症通路等信号通路中。PI3K-AKT信号通路作为经典信号通路，可以通过上调其上游信号因子磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）和抑制其下游信号因子蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）的表达，调节卵泡的生长发育，改善卵巢功能和调节月經周期[21]，减轻患者出血的症状。雌激素受体信号通路及其通路中的基因可以调节下丘脑-垂体-卵巢轴功能，调节雌激素水平，减缓子宫内膜的生长速度[22]，修复创面，从而减少患者的子宫出血量。固本止崩汤可以有效调节患者的雌激素和孕激素水平，降低患者的子宫内膜厚度[5]，减轻患者的子宫出血症状，提高患者的生命质量。说明固本止崩汤可以通过多成分、多靶点、多通路治疗功能失调性子宫出血。

综上所述，本文运用网络药理学的方法对固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的靶点及其潜在作用机制进行了分析与探讨，揭示了固本止崩汤可以通过多成分、多靶点、多通路协同作用于功能失调性子宫出血。由以上证实固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的作用机制较为复杂，为进一步探讨固本止崩汤治疗功能失调性子宫出血的机制，仍需要后续的实验验证。

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（2020-08-24收稿 本文编辑：苍宁）