粉防己碱对慢性炎性疼痛的镇痛作用

李峰 孙丹妮 娄峥 龚邦 周亚丽 余明辉 卿兰玉

摘要 目的：研究粉防己碱对弗氏完全佐剂（FCA）致慢性炎性疼痛小鼠模型的镇痛作用。方法：建立FCA足底慢性炎性疼痛模型，使用粉防己碱进行干预治疗，结合机械刺激、热辐射刺激、热板实验及伤害性反应等疼痛行为学检测方法鉴定其镇痛作用特点，使用实时PCR、蛋白质印迹法等检测辣椒素瞬时受体电位1（TRPV1） mRNA和蛋白表达变化，探究其干预作用TRPV1敏化调控途径机制。结果：获得了慢性炎性疼痛的小鼠模型。粉防己碱可显著增加该慢性炎性疼痛模型的机械刺激和热辐射刺激痛阈值，却不影响该模型的热板刺激痛阈值及小鼠体质量，与正常对照组比较，粉防己碱干预后，FCA致慢性炎性疼痛小鼠模型的TRPV1产生明显减少（P<0.05）。结论：粉防己碱能显著抑制FCA致慢性炎性疼痛小鼠模型的TRPV1产生，对慢性炎性疼痛具有镇痛作用，且未发现耐受性及毒性。

关键词 粉防己碱;弗氏完全佐剂;慢性炎性疼痛;疼痛机制;辣椒素瞬时受体电位1;镇痛;干预治疗;行为学检测

Analgesic Effect of Tetrandrine on Chronic Inflammatory Pain

LI Feng，SUN Danni，LOU Zheng，GONG Bang，ZHOU Yali，YU Minghui，QING Lanyu

（Changsha Medical University，Changsha 410219，China）

Abstract Objective：To investigate the analgesic effect of tetrandrine（TEF） on chronic inflammatory pain induced by Freund′s complete adjuvant（FCA） in mice.Methods：A FCA plantar chronic inflammatory pain model was established，and TEF was used to conduct intervention treatment.The analgesic effect of TEF was determined by pain behavioral tests of mechanical stimulation，thermal radiation stimulation，hot-plate test，and nociceptive response.Real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR），Western blot and other methods were used to detect the messenger ribonucleic acid（mRNA） and protein expression changes of transient receptor potential vanilloid-1（TRPV1），and to explore the regulatory pathway and mechanism of TRPV1 sensitization.Results：The model of chronic inflammatory pain in mice was obtained.TEF significantly increased the pain thresholds of mechanical stimulation and thermal radiation stimulation in mice，but did not affect the pain threshold of hot plate stimulation and the weight of mice.Compared with the control group，TRPV1 in the mice with FCA-induced chronic inflammatory pain was significantly reduced after the intervention of TEF（P<0.05）.Conclusion：TEF significantly inhibited the production of TRPV1 in the mice with FCA-induced chronic inflammatory pain，and had analgesic effect on chronic inflammatory pain.No tolerance or toxicity of TEF has been found.

Keywords Tetrandrine; Complete Freund′s adjuvant; Chronic inflammatory pain; Pain mechanisms; Transient receptor potential vanilloid-1; Analgesic effect; Intervention therapy; Behavioral tests

中圖分类号：R277.7;R285.5;R749.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.015

疼痛是90%以上人类疾病所共同具有的症状。世界卫生组织提出“慢性疼痛是一种疾病”[1]。其中，尤以慢性炎性疼痛（Inflammatory Pain）最为常见，它表现出持久性、反复性的疼痛。慢性炎性疼痛发病机制非常复杂，研究表明慢性炎性疼痛首先由损伤组织释放大量的肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎症介质，继而引发炎症反应并产生一系列致痛物质，这些炎症介质及致痛物质通过刺激外周伤害性感受器，在该伤害性感受器中将伤害性刺激转换成动作电位，传入外周伤害性感受器末端及背根神经节，并将存在于其中的瞬时受体电位（Transient Receptor Potential，TRP）离子通道尤其是辣椒素瞬时受体电位（Tansient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1）通道敏化，引起疼痛[2-3]。慢性炎性疼痛的产生和发展激活了TRPV1通道蛋白的表达;在慢性炎性疼痛模型中，TRPV1拮抗剂能明显增高机械痛阈值和热敏痛阈值，从而使TRPV1通道蛋白成为普遍关注的疼痛治疗靶点。

目前临床上镇痛药主要有阿片类（Opioids）和非甾体抗炎药（Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug，NSAID），然而，阿片类药物常常会产生耐受性、嗜睡、便秘、抑制呼吸和成瘾性等不良反应[4];NSAID也会伴随胃溃疡、胃出血、心肌梗死和脑卒中等不良反应;因此，临床镇痛治疗受到一定的限制。近年来，中医药对慢性炎性疼痛的镇痛作用研究越来越多[5-7]。

粉防己，防己科植物粉防己草（Stephania tetrandra S.Moore）的干燥根，常用于治疗水湿所致的水肿病、风湿性关节炎，其所治疗疾病多伴随炎症、疼痛等临床表现。然而，有关粉防己及其有效成分抑制慢性炎性疼痛的具体机制尚不明确[8-9]。通过弗氏完全佐剂（Freund′s Complete Adjuvant，FCA）致慢性炎性疼痛小鼠模型，初步探讨粉防己碱（Tetrandrine，TET）对慢性炎性疼痛小鼠的镇痛作用与机制，确定粉防己碱的药效及最佳给药时间和给药剂量，并初步揭示粉防己碱的外周镇痛机制，评价其毒性大小和耐受性，验证粉防己碱的镇痛作用与TRPV1的相关性，从局部到系统、形态到功能进行研究，以明确粉防己碱的慢性炎性疼痛干预作用途径和靶点[10-12]。本研究通过FCA致慢性炎性疼痛小鼠模型探讨粉防己碱在慢性炎性疼痛中的镇痛作用及其TRPV1敏化调控途径机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取美国癌症研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠60只，8～10周龄，体质量（20～30 g），解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（军）2016-0004，飼养环境：无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级，温度（24±2）℃，湿度（50±10）%，光照周期6：00～18：00，12 h昼夜交替。

1.1.2 药物 粉防己碱（纯度大于98%，材料和生物制品研究所，货号：17011）。

1.1.3 试剂与仪器 弗氏完全佐剂（Chondrex公司，美国，货号：7001），转染试剂Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国，货号：87294），TRPV1多克隆抗体（Alomone Labs公司，以色列，货号：65296），MTT检测试剂盒（北京荣京生物科技有限公司，货号：34008），热测痛仪（Ugo Basile Sri公司，意大利，型号：37360），智能热板仪（Ugo Basile Sri公司，意大利，型号：35100），机械爪触觉测试仪（Ugo Basile Sri公司，意大利，型号：37450），荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国，型号：CFX96）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将ICR小鼠分为6组，每组10只：正常组，正常+TET高剂量组（1.2 g/kg），FCA组，FCA+TET低、中、高剂量组（0.3、0.6、1.2 g/kg）。于FCA+TET低、中、高剂量组和FCA组小鼠右后足底皮下，取1 mL注射器缓慢注射20 μL FCA溶液，2 d后，与正常组比较小鼠行为活动明显减少，与小鼠左后足比较，右后足出现明显红肿，表明造模成功。取1 mL注射器将正常+TET高剂量组和正常组小鼠右后足底皮下缓慢注射20 μL吐温-80（Tween-80）溶液，2 d后，正常+TET高剂量组与正常组比较小鼠行为活动未有差异，与小鼠左后足比较，正常+TET高剂量组和正常组小鼠右后足没有出现明显红肿。

1.2.2 给药方法 正常组和FCA组按容积为10 mL/kg，灌胃双蒸水，连续灌胃7 d，正常+TET高剂量组和FCA+TET低、中、高剂量组按给药容积10 mL/kg分别灌胃各剂量的TET，连续灌胃给药7 d，并相应地进行机械刺激和热辐射痛阐测定。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 机械刺激痛阈值测定 将实验动物小鼠放置于机械测痛仪中金属网上，盖上有机玻璃透明分格罩，先让小鼠适应10～20 min，待小鼠安静下来及其活动明显减少或者消失后，用von Frey机械刺激针（0.04～2 g）垂直刺激小鼠右后脚掌中部，使刺激针成90°弯曲并维持2～4 s，观察小鼠刺激足反应情况，若小鼠在刺激时间内没有弹足、缩足、舔足活动反应则记为阴性;若小鼠在刺激时间内出现迅速的弹足、缩足、舔足活动则记为阳性反应，分别于连续灌胃第1天的0、l、2、3、4、24 h及灌胃的3、5、7 d给药1 h后测定机械刺激痛阈值。

1.2.3.2 热辐射痛阈值测定 取ICR小鼠，分组同上，正常组及模型组小鼠灌胃给予双蒸水，各给药组小鼠灌胃给予相应剂量的TET。将小鼠置于热辐射测痛仪中适应10～20 min，待小鼠活动明显减少或者消失安静后灌胃给药，1 h后，用红外辐射热源对准小鼠右后足底中部，记录从照射开始到引起右后足弹足、缩足、舔足的潜伏时间。将小鼠的基础热辐射潜伏时间调整为9～12 s，将20 s（超过20 s按20 s计）作为小鼠最大潜伏时间，以防止小鼠足组织损伤，并分别在小鼠连续灌胃双蒸水或者TET（0.34～1.35 g/kg）2、4、6 d的1 h后测定热辐射潜伏时间。每只小鼠每隔5 s测定一次热辐射潜伏时间，测定3次，以3次测定的平均潜伏时间作为该小鼠最终测定的实验结果。

1.2.3.3 热板实验 热板仪预先加热至45 ℃，将各组雌性小鼠放入热板检测仪中，从放入开始至小鼠肿胀足出现舔足、弹足的时间作为热板潜伏时间，为防止出现小鼠组织损伤，潜伏时间不宜超过20 s。

1.2.6 实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白质印迹法（Western Blotting，WB）在TET给药15 d后，将小鼠乙醚麻醉处死。对受伤后爪皮肤的足底表面进行解剖，并将其保存于-80 ℃待Real-time PCR和WB分析，Real-time PCR和WB测定TRPV1在后爪组织和小鼠背根神经节中的表达。使用了以下抗体：TRPV1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH），以山羊抗兔抗体与辣根过氧化物酶（1∶5 000）结合为第二抗体。对照GAPDH对TRPV1蛋白水平进行归一化处理，所有实验重复4次。检测小鼠伤害性感觉神经末梢及背根神经节TRPV1蛋白的表达变化。

1.3 统计学方法 釆用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，方差不齐性采用秩和检验，方差齐性采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛小鼠机械痛阈值的影响 FCA诱导的慢性炎性疼痛模型组与正常组比较，小鼠机械痛阈值连续7 d均表现显著降低（P<0.001）;小鼠灌胃粉防己堿各组（5、15、45、60 mg/kg）与模型组比较，呈剂量依赖性地提高FCA诱导小鼠的机械痛阈值（P<0.05），从灌胃后0～1 h，小鼠机械痛阈值呈上升趋势，给予粉防己碱后1 h时的镇痛作用最强，从灌胃1 h之后，小鼠机械痛阈值呈下降趋势，同时低剂量组在给药1.5 h后粉防己碱的药效消失，中剂量组粉防己碱的镇痛作用能持续3 h（P<0.05），高剂量组粉防己碱的镇痛作用能持续4 h（P<0.05）。粉防己碱连续给药7 d，各剂量组对小鼠机械痛阈值的提高在第7天与第1天趋势相似。见图1。此外，粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛小鼠治疗7 d后不会引起明显的体质量变化。见图2。

2.2 粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛小鼠热辐射潜伏时间的影响 FCA连续诱导2、4、6 d模型组与正常组比较，热辐射潜伏时间均显著降低（P<0.001），且热辐射潜伏时间均稳定在4 s上下，该模型稳定且持续时间长。与模型组比较，粉防己碱连续给药2、4、6 d，粉防己碱各剂量组（5、15、45、60 mg/kg）的热辐射潜伏时间比模型组均显著升高（P<0.05），且随着剂量的增大而显著升高，同时粉防己碱连续给药的2、4、6 d的镇痛作用相似，与机械痛阈值的测定结果一致。见图3。

2.3 粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛小鼠热板痛阈值的影响 与模型组比较，TET能明显升高小鼠的热板痛阈值（P<0.05）;与正常组比较，FCA诱导模型组热板潜伏时间显著减少（P<0.001）。见图4。

2.4 粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛小鼠TRPV1表达的影响 在FCA诱导的小鼠受伤爪子的背根神经节和皮肤中，由于TRP通道的过度表达与炎症超敏反应相关，因此在FCA诱导的小鼠中进一步检测了TRPV1的蛋白表达。Real-time PCR和WB分析发现，粉防己碱（5、15、45 mg/kg）治疗以剂量相关的方式显著降低了FCA诱导的炎症后损伤爪皮肤中TRPV1的产生。见图5。

3 讨论

粉防己碱始载于我国《神农本草经》，广泛分布于湖南、广东、安徽等南方地区，作为我国传统的中药材，多用于慢性炎性疼痛的治疗。目前有关粉防己碱抗炎镇痛作用的机制研究主要认为是抑制一氧化氮（NO），肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α），白细胞介素-6（Interleukin，IL-6）等炎症介质的释放及降低核因子κB的活化或抑制IKKb/IκB/NF-κB通路[13]。研究报道，粉防己碱能通过降低体内钙离子水平发挥镇痛作用，然而，有关粉防己碱抑制FCA致小鼠慢性炎性疼痛及机制尚未见明确报道。因此利用FCA诱导建立小鼠痛觉增敏模型观察粉防己碱对痛觉增敏有无镇痛作用，初步探讨其镇痛机制。

根据前期实验室与临床研究得知，粉防己碱具有抗炎镇痛和免疫调节特点，结合外周炎症介质—TRPV1敏化调节途径，我们推测粉防己碱能通过抑制炎症介质的释放降低TRPV1敏化从而发挥镇痛作用[14-15]。

FCA致痛模型是研究炎性疼痛较理想的动物模型之一[16]，作为慢性炎性疼痛的经典模型，小鼠足底注射FCA建立FCA致慢性炎性疼痛模型疼痛持续时间长，可达3周以上且稳定，该模型主要广泛应用于缓解慢性炎性疼痛镇痛药物研究中对机械刺激和热敏刺激敏感的测定，通过该模型给予灌胃TET，发现TET在不影响正常小鼠基础机械痛阈值的同时能有效提高FCA小鼠机械痛阈值，同时TET还能明显提高炎症状态下小鼠的热敏刺激痛阈值。研究发现，与正常组比较，正常小鼠给予粉防己碱组没有统计学差异，粉防己碱对于FCA致慢性疼痛模型没有耐药性，说明粉防己碱只对病理状态机体发挥镇痛作用[17-18]。众所周知，耐受性和其他不良反应，如体质量减轻和胃黏膜溃疡等，限制了目前临床镇痛药物的使用。上述研究结果显示粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛模型有镇痛作用，且无耐受性。前期实验显示TRPV1拮抗剂（AMG9810）可以抑制粉防己碱提高小鼠热板痛阈值的作用，提示TRPV1受体可能参与了粉防己碱的中枢镇痛机制，同时免疫组织化学染色分析表明，FCA组TRPV1阳性神经元的数量与对照组比较显著增加，而口服粉防己碱降低了这些阳性神经元的百分比。本研究进一步探讨确定了粉防己碱对FCA致慢性炎性疼痛小鼠的镇痛作用与其伤害性感受器末端和背根神经节TRPV1蛋白表达相关性，前期研究报道炎症介质能促进TRPV1的敏化，该结果可以说明粉防己碱可能通过减少外周相应炎症介质的释放从而降低伤害性感觉神经末梢和背根神经节中TRPV1 mRNA及TRPV1蛋白表达而发挥镇痛作用[19-20]。

综上所述，本实验证明了粉防己碱呈剂量依赖性的抑制FCA致痛模型，其对慢性炎性疼痛的镇痛效应与抑制TRPV1的表达有关，鉴于慢性炎性疼痛发病机制的复杂性及粉防己多方面的药理活性作用特点，本研究对指导临床合理用药及进一步研发高效低毒的新型多靶点镇痛药物具重要意义，也为揭示中医药功效作用和拓展运用提供更可靠的理论和实验依据。

参考文献

[1]Ji RR，Nackley A，Huh Y，et al.Neuroinflammation and Central Sensitization in Chronic and Widespread Pain[J].Anesthesiology，2018，129（2）：343-366.

[2]Huang Y，Ma S，Wang Y，et al.The Role of Traditional Chinese Herbal Medicines and Bioactive Ingredients on Ion Channels：A Brief Review and Prospect[J].CNS Neurol Disord Drug Targets，2019，18（4）：257-265.

[3]Zhang YQ，Wang C，Guo QY，et al.Molecular mechanisms of the analgesic action of Wu-tou Decoction on neuropathic pain in mice revealed using microarray and network analysis[J].Acta Pharmacol Sin，2018，39（6）：988-997.

[4]Montes GC，da Silva B，Rezende B，et al.The Hypnotic，Anxiolytic，and Antinociceptive Profile of a Novel μ-Opioid Agonist[J].Molecules，2017，22（5）：800.

[5]黄慈波，吴振彪，姜泉，等.祛风止痛胶囊对膝骨关节炎患者疼痛及膝关节功能评分的影响[J].中国新药杂志，2019，28（23）：2860-2864.

[6]Apkhazava M，Kvachadze I，Tsagareli М，et al.Gender-related correlation of pain sensation，MOR level and some hostility indices[J].Georgian medical news，2019（288）：114-120.

[7]韦琳，宗伟，曾庆鸿，等.花椒抗炎镇痛网络药理学分析及实验验证研究[J].中国中药杂志，2021，46（12）：3034-3042.

[8]Caplan A，Fett N，Rosenbach M，et al.Prevention and management of glucocorticoid-induced side effects：A comprehensive review：Ocular，cardiovascular，muscular，and psychiatric side effects and issues unique to pediatric patients[J].J Am Acad Dermatol，2017，76（2）：201-207.

[9]Walker C，Biasucci LM.Cardiovascular safety of non-steroidal anti-inflammatory drugs revisited[J].Postgrad Med，2018，130（1）：55-71.

[10]Melo Júnior JM，Damasceno MB，Santos SA，et al.Acute and neuropathic orofacial antinociceptive effect of eucalyptol[J].Inflammopharmacology，2017，25（2）：247-254.

[11]Conaghan PG，Cook AD，Hamilton JA，et al.Therapeutic options for targeting inflammatory osteoarthritis pain[J].Nat Rev Rheumatol，2019，15（6）：355-363.

[12]Ottolini M，Hong K，Sonkusare SK.Calcium signals that determine vascular resistance[J].Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med，2019，11（5）：e1448.

[13]Talavera K，Startek JB，Alvarez-Collazo J，et al.Mammalian Transient Receptor Potential TRPA1 Channels：From Structure to Disease[J].Physiol Rev，2020，100（2）：725-803.

[14]Moran MM，Szallasi A.Targeting nociceptive transient receptor potential channels to treat chronic pain：current state of the field[J].Br J Pharmacol，2018，175（12）：2185-2203.

[15]Baral P，Udit S，Chiu IM.Pain and immunity：implications for host defence[J].Nat Rev Immunol，2019，19（7）：433-447.

[16]Moore C，Gupta R，Jordt SE，et al.Regulation of Pain and Itch by TRP Channels[J].Neurosci Bull，2018，34（1）：120-142.

[17]Gouin O，L′Herondelle K，Lebonvallet N，et al.TRPV1 and TRPA1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation：pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization[J].Protein Cell，2017，8（9）：644-661.

[18]Hall OM，Broussard A，Range T，et al.Novel Agents in Neuropathic Pain，the Role of Capsaicin：Pharmacology，Efficacy，Side Effects，Different Preparations[J].Curr Pain Headache Rep，2020，24（9）：53.

[19]Takaoka K，Cyril AC，Jinesh S，et al.Mechanisms of pain in sickle cell disease[J].Br J Pain，2021，15（2）：213-220.

[20]Kameda T，Zvick J，Vuk M，et al.Expression and Activity of TRPA1 and TRPV1 in the Intervertebral Disc：Association with Inflammation and Matrix Remodeling[J].Int J Mol Sci，2019，20（7）：1767.

（2020-07-22收稿 本文編辑：王明）