基于微卫星引物鉴别不同地理种群玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂

安仕博，陈 旭，戴 鹏，侯洋旸，臧连生，*

(1.吉林农业大学生物防治研究所，长春 130118；2. 贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室，贵阳 550025)

赤眼蜂Trichogrammaspp.属膜翅目小蜂总科赤眼蜂科，是现代农林害虫生物防治上应用范围最广、防治效果最好的天敌昆虫(Smith, 1996)。目前已被广泛应用于玉米ZeamaysL.、水稻OryzasativaL.、果蔬等多种农林害虫的防控，并且表现出很好的生物防治潜能(何晓芳等, 2005; 张俊杰等, 2015; Zangetal., 2021)。赤眼蜂属种类繁多，已报道有200余种，其寄主范围广泛，对鳞翅目农林害虫的防治效果尤为显著(邱益三, 1978; 李丽英, 1984; Pinto, 1999)。其中，玉米螟赤眼蜂Trichogrammaostriniae和螟黄赤眼蜂Trichogrammachilonis作为寄生亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)卵的优势蜂种，是影响玉米螟种群消长的重要天敌因素(张荆等, 1990; 袁佳等, 2011)。目前，在我国东北地区，每年约有550万ha的玉米田使用玉米螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂和其他赤眼蜂蜂种来防治亚洲玉米螟(Wangetal., 2014)。

赤眼蜂种类和品系的选择是影响其田间防效的重要因素(王振营和周大荣, 1995; Hassanetal., 2004; Chailleuxetal., 2012)，其不同地理种群间生物学和生态适应性常存在较大差异，且具有丰富的遗传多态性。为有效开发利用优势种群、监测田间种群、避免赤眼蜂人工繁育中的蜂种混杂以及追踪并评估其田间释放后的防控效果，赤眼蜂的鉴定无疑是至关重要的 (Stouthamer, 2006)。赤眼蜂的鉴定方法主要包括形态学鉴定和分子生物学鉴定。由于体型小，且近似种间形态十分相近，这些因素给赤眼蜂的鉴定，尤其对于种内的不同地理种群的区分带来困难。因此，目前赤眼蜂不同地理种群的区分，主要靠分子手段来实现(严智超等, 2020)。

由于赤眼蜂基因组基因数目庞大，进行全面的序列分析很难实现，需要利用DNA分子标记，对基因组中个别特征基因片段进行重点研究，因此选择合适的分子标记片段是赤眼蜂分子鉴定及地理种群鉴别中关键所在。目前在昆虫系统学研究中采用的DNA分子标记有微卫星DNA、核糖体DNA和线粒体DNA(余道坚等, 2003)。微卫星(Simple sequence repeat, SSR)，又称简单重复序列，是以1～6 bp核苷酸为重复单位的特殊序列。近年来，随着分子标记技术的不断发展，由于SSR在基因组中表现出高度的长度多态性和丰富的信息含量，以及杂合性高、侧翼基因保守且操作简单等特点，被应用于赤眼蜂分子鉴定研究中(代金霞, 2005; 瞿陆峰等, 2010; 柳莹等, 2014)，如Lü and Han(2016)发现松毛虫赤眼蜂TrichogrammadendrolimiMatsumura的26个多态性微卫星标记，用于分析松毛虫赤眼蜂的遗传变异，Pizzol等(2005)利用SSR分子标记区分突尼斯和法国不同地理种群的卷蛾赤眼蜂TrichogrammacacoeciaeMaechal。本研究基于微卫星标记技术，筛选出能够快速区分不同地理种群玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂的微卫星引物，为赤眼蜂种类和品系的选择提供高效检测手段和有力依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

2018年在黑龙江省、吉林省、辽宁省、广东省和贵州省等地的玉米田中采集被寄生的玉米螟卵块，待寄生的赤眼蜂羽化后根据雄性外生殖器特征鉴定(庞雄飞, 1985)，共采集到3种不同地理种群的玉米螟赤眼蜂和3种不同地理种群的螟黄赤眼蜂，分别是黑龙江玉米螟赤眼蜂(HLJ-To)、吉林玉米螟赤眼蜂(JL-To)、辽宁玉米螟赤眼蜂(LN-To)、贵州螟黄赤眼蜂(GZ-Tc)、黑龙江螟黄赤眼蜂(HLJ-Tc)和广东螟黄赤眼蜂(GD-Tc)。将采集到的蜂种在25±1℃，相对湿度 70%±5%的条件下，以紫外光照射30 min杀胚处理过的新鲜米蛾CorcyracephalonicaStainton卵作为中间寄主连续繁育3代，后转接玉米螟卵繁育1代进行复壮。

1.2 主要试剂和仪器

无菌水、CTAB试剂、核酸助沉剂、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、无水乙醇、TE缓冲液、DNA Marker、丙烯酰胺、二叉丙烯酰胺和TBE缓冲液等试剂均采购于上海生工生物工程有限公司，所用SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

所用仪器有组织细胞破碎仪(杰灵TP-24)、高速低温离心机(Eppendorf 5430R)、干式恒温器(杭州瑞诚DH100-4)、PCR仪(Eppendorf 6333)、电泳仪(BIO-RAD 1645070)、垂直电泳槽(北京君意JY-JX5L)、超微量核酸蛋白测定仪(德国耶拿ScanDrop2)、水平摇床(北京六一WD-9405D)和胶片观察灯(北京六一WD-9406)。

1.3 试验方法

1.3.1赤眼蜂DNA的提取

参照CTAB法(Doyle and Doyle, 1987)提取赤眼蜂DNA，并进行改进，选取各地理种群赤眼蜂的成蜂，将单头赤眼蜂放入1.5 mL离心管中，加入100 μL 2% CTAB溶液和适量研磨珠，放入研磨机中进行研磨(speed：3，time：50 s)，取出后每个离心管中加入2.5 μL蛋白酶K，55℃水浴2 h。水浴完成后加入100 μL氯仿异戊醇(氯仿 ∶ 异戊醇=24 ∶ 1)充分混匀，4℃离心10 min，取出后抽取上清液80 μL，加入160 μL无水乙醇和2.5 μL核酸助沉剂，置于-20℃冷冻2 h，取出后4℃离心15 min，弃掉上清液，金属浴烤干后加入30 μL TE缓冲液进行溶解，使用ScanDrop2检测DNA浓度和纯度，并于-20℃冰箱保存备用。

1.3.2SSR引物的筛选

本研究所采用的微卫星引物均从玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂的近缘物种松毛虫赤眼蜂TrichogrammadendrolimiMatsumura(Lü and Han, 2016)开发的引物中进行选取，从中筛选出10对引物分别对玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂DNA样本进行PCR扩增，引物序列详见表1。

1.3.3PCR反应

PCR反应体系为25 μL：提取的各地理种群赤眼蜂的DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × Taq MasterMix 12.5 μL，无菌水10.5 μL。PCR程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增后，产物用8%聚丙烯酰氨凝胶法，将胶板固定在电泳槽中，缓慢加入1×TBE至没过胶面，用移液器分别吸取0.5 μL样品加入点样孔中。在500 V/20 A恒压条件下电泳60～90 min，银染显影3～5 min后拍照，用Gene Mapper v4.0(Applied Biosystems，CA，USA)软件对图像进行处理和分析，得到各地理种群赤眼蜂微卫星各位点片段的大小和位置，筛选条带明显、清晰且可以区分各地理种群赤眼蜂的微卫星位点及引物。

表1 微卫星位点及引物特征

1.3.4数据分析

使用软件GenAlEx version 6.5对等位基因数(Number of Allele, Na)、有效等位基因数(Effective Number of Allele, Ne)、观测杂合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity, He)及多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)进行分析(Peakall & Smouse, 2012)；并用GenAlEx version 6.5和软件CREATE将数据转换为其它软件后续分析所需的数据格式；基因多样性(Gene diversity, Hs)使用软件FSTAT Version 2.9.3.2(Lietal., 2010)进行分析。

2 结果与分析

2.1 玉米螟赤眼蜂3个地理种群的引物筛选

以玉米螟赤眼蜂DNA为模板，利用优化后的反应程序进行SSR-PCR引物1～10的筛选。根据扩增结果，淘汰扩增缺失条带(引物2、7和9)、扩增效果不稳定(引物1和5)以及条带位置相同(引物3、4和10)，其中引物6和引物8都可以稳定扩增出明显且清晰的特异性条带；在3种玉米螟赤眼蜂中，JL-To与LN-To之间无法区分，HLJ-To与其余两种可利用引物6和引物8进行区分(图1)。

图1 玉米螟赤眼蜂3个地理种群的引物筛选结果Fig.1 Results of primer screening of three geographical populations of Trichogramma ostriniae注：每4条泳道对应1对引物的扩增结果，4条泳道分别对应Marker(M)、JL-To(A)、HLJ-To(B)和LN-To(C)。Note: Every four lanes corresponded to the amplification results of one pair of primers, and the four lanes corresponded to Marker (M), JL-To (A), HLJ-To (B) and LN-To (C)， respectively.

2.2 螟黄赤眼蜂3个地理种群的引物筛选

以螟黄赤眼蜂DNA为模板，利用优化后的反应程序进行SSR-PCR引物1～10的筛选。根据扩增结果，淘汰扩增缺失条带(引物2)、扩增效果不稳定(引物1和引物9)以及条带位置相同(引物4、5、6、7和10)，引物3和引物8都可以稳定扩增出明显且清晰的特异性条带；在3个地理种群的螟黄赤眼蜂中，HLJ-Tc与GZ-Tc和GD-Tc之间可以用引物3区分；GZ-Tc与GD-Tc和HLJ-Tc之间可以用引物8区分(图2)。

图2 螟黄赤眼蜂3个地理种群的引物筛选结果Fig.2 Results of primer screening of three geographical populations of Trichogramma chilonis注：每4条泳道对应1对引物的扩增结果，4条泳道分别对应Marker(M)、GZ-Tc(A)、GD-Tc(B)和HLJ-Tc(C)。Note: Every four lanes corresponded to the amplification results of one pair of primers, and the four lanes corresponded to Marker (M), GZ-Tc (A), GD-Tc (B) and HLJ-Tc (C)， respectively.

2.3 赤眼蜂4个微卫星位点的遗传多样性及多态性信息含量分析

赤眼蜂6个不同地理种群中能够稳定扩增的4个微卫星位点的遗传多样性及多态信息含量见表2。4个微卫星位点TD3、TD6、TD8和TD10的多态信息含量(PIC)分别为0.141～0.746。其中TD8和TD10位点的PIC值分别为0.746和0.703，均大于0.5，均具有较高的多态性；位点TD3位点的PIC值为0.477，表现为中等多态性，而在TD6位点的PIC值仅为0.141，为低度多态性；4个位点平均PIC为0.517，整体表现为中度多态性。能够稳定扩增的4个微卫星位点的平均等位基因数(Na)为1.5个，有效等位基因数(Ne)为1.5个，等位基因丰富度(Ar)为1.5个，平均观测杂合度(Ho)为0.5，平均期望杂合度(He)为0.25。

表2 赤眼蜂4个微卫星位点的多态性特征

2.4 退火温度对玉米螟赤眼蜂不同地理种群微卫星鉴定结果的影响

利用引物6和引物8按照上述反应程序，分别对玉米螟赤眼蜂3个地理种群的DNA模板进行扩增，并将退火温度分别设为51℃、53℃、55℃、57℃和59℃。检测结果表明(每条泳道上方的数字代表退火温度)，退火温度对引物6的PCR结果影响较大，当退火温度超过55℃时，HLJ-To会出现明显的条带缺失，无法与其它两个地理种群进行区分；退火温度对引物8的PCR结果影响不大，玉米螟赤眼蜂3个地理种群均能在51～59℃的条件下扩增出明显的特异性条带(图3)。

图3 退火温度对玉米螟赤眼蜂3个地理种群微卫星鉴定结果的影响Fig.3 Effects of annealing temperature on microsatellite detection of three populaitons of Trichogramma ostriniae

2.5 退火温度对螟黄赤眼蜂不同地理种群微卫星鉴定结果的影响

利用引物3和引物8按照上述反应程序，分别对螟黄赤眼蜂3个地理种群的DNA模板进行扩增，并将退火温度分别设为51℃、53℃、55℃、57℃和59℃。检测结果表明(每条泳道上方的数字代表退火温度)，退火温度对各引物的PCR结果影响不大，3个地理种群的螟黄赤眼蜂均能在51～59℃的条件下扩增出明显的特异性条带，但是在55℃时差异最明显(图4)。

图4 退火温度对螟黄赤眼蜂3个地理种群微卫星鉴定结果的影响Fig.4 Effects of annealing temperature on microsatellite detection of three populations of Trichogramma chilonis

2.6 基于筛选微卫星引物对不同地理种群玉米螟赤眼蜂的鉴定结果

选取3个地理种群的玉米螟赤眼蜂成蜂各5头，按照1.3中提到的方法提取DNA，分别利用引物6和引物8进行扩增，以鉴定不同地理种群的玉米螟赤眼蜂。结果表明(每5条泳道代表1个地理种群)，图中引物6和引物8可以明确的区分出HLJ-To和JL-To以及LN-To之间存在的基因型差异，但JL-To和LN-To之间暂时无法区分(图5)。

图5 基于筛选微卫星引物对不同地理种群玉米螟赤眼蜂的鉴定结果Fig.5 Identification of Trichogramma ostriniae from different geographical populations based on microsatellite primers

2.7 基于筛选微卫星引物对不同地理种群螟黄赤眼蜂的鉴定结果

选取3个地理种群的螟黄赤眼蜂成蜂各5头，按照1.3中提到的方法提取DNA，分别用引物3和引物8进行扩增，以鉴定不同地理种群的螟黄赤眼蜂。结果表明(每5条泳道代表1个地理种群)，引物3可以明确的区分出HLJ-Tc和GZ-Tc以及GD-Tc之间存在基因型差异，引物8可以明确的区分GZ-Tc和GD-Tc以及HLJ-Tc之间存在基因型差异(图6)。

图6 基于筛选微卫星引物对不同地理种群螟黄赤眼蜂的鉴定结果Fig.6 Identification of Trichogramma chilonis from different geographical populations based on screened microsatellite primers

3 结论与讨论

物种对于环境的适应能力主要取决于其遗传的多样性。遗传分化越丰富，对于环境的适应能力越强；反之，遗传分化越单一，适应能力和生存潜力越弱(祖元刚, 1999)。本研究利用微卫星分子标记，筛选了可以用于区分不同地理种群的玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂微卫星引物，并发现本研究涉及的不同地理种群的玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂存在基因型的差异。

虽然微卫星位点的侧翼区序列在种内具有高度的保守型，但在研究中发现，由于微卫星位点侧翼序列突变或位点缺失、环境因素或PCR反应条件变化的影响，即使是相同物种的微卫星引物也会出现扩增失败的情况(Paetkau and Strobeck, 1995; Raveletal., 2002; 门秋雷等, 2012)。本研究从已报道的10种微卫星引物中，选出4对可以扩增出稳定条带的微卫星引物TD3、TD6、TD8和TD10(序列号：KT834822，KT834825，KT834827，KT834829)，但由于6个种群在TD10位点下扩增的条带均相同，不适用于区分不同地理种群。杂合度是衡量微卫星位点遗传多样性的重要指标，两者与微卫星位点的遗传多样性呈正相关。期望杂合度则能够反映出不同遗传结构之间的变异程度，一般将杂合度高于0.1的位点称为多态位点。本研究中TD8位点的期望杂合度为0.333，具有较高的多态性和丰富的遗传多样性。而位点TD3和TD6的期望杂合度为0.083，为低多态性位点。多态信息含量(PIC)是衡量微卫星多态性的重要指标，当PIC>0.5时，该微卫星位点为高度多态性位点(Botsteinetal., 1980)。微卫星位点的PIC与该位点的可用性及使用效率相关，PIC越高，种群中该微卫星位点的杂合子比例越高，能够提供的遗传信息就越多。本研究中，除了TD6位点以外，TD3和TD8位点均具有中等到较高的多态性，能为赤眼蜂遗传多样性研究提供充分的遗传信息。最终筛选出2对引物(序列号：KT834825，KT834827)可以区分HLJ-To与JL-To和LN-To，但JL-To与LN-To之间无法区分，初步说明这两个地理种群之间的遗传分化程度可能很低；同时也筛选出2对引物(序列号：KT834822，KT834825)可以区分GZ-Tc、GD-Tc和HLJ-Tc 3个种群。这说明几种不同地理种群赤眼蜂间存在一定的基因型差异，可能与地理距离有关。

因赤眼蜂飞行能力弱，所以区域之间的基因交流程度低，且不同地理种群之间可能发生与寄主之间的协同进化，从而形成不同程度的遗传差异性(李宝娟, 1992)。但本研究涉及的不同地理种群的赤眼蜂之间遗传分化程度与地理距离的相关性还需要进一步的实验验证。本研究也发现不同退火温度对于筛选出的引物的扩增效率影响不大，说明筛选出的引物对于退火温度要求不高，特异性较强，但在利用引物6进一步鉴定和其它试验中，建议使用退火温度为55℃，以获得最优的结果。

不同来源的寄生蜂由于受到环境因素的影响，其寄生能力、羽化率以及雌雄比等生物学特性之间往往存在较大的差异，从而影响对靶标害虫的防治效果(Hassan, 1989; 董贝等, 2012)。在实际生产中，利用柞蚕卵作为繁育寄主可以有利于赤眼蜂的工厂化繁育，提高生产效率，同时降低成本。有研究表明，由于柞蚕卵卵壳较为坚硬，大多数的玉米螟赤眼蜂都无法寄生柞蚕卵，但有些地理种群的玉米螟赤眼蜂能够寄生柞蚕卵，只是无法成功羽化(Hassanetal., 2004; 李树英等, 2013)。最近的研究发现，玉米螟赤眼蜂和其它种类的赤眼蜂共寄生柞蚕卵可以帮助玉米螟赤眼蜂羽化出蜂，例如，与松毛虫赤眼蜂共寄生柞蚕卵可以让玉米螟赤眼蜂利用松毛虫赤眼蜂的羽化孔完成出蜂(田春雨等, 2019)；而与螟黄赤眼蜂共寄生可以让玉米螟赤眼蜂利用螟黄赤眼蜂的羽化孔完成出蜂(Iqbaletal., 2020)。这为今后高效繁育和利用玉米螟赤眼蜂提供了可能性和新的思路，但不同地理种群的玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂之间的共寄生和辅助羽化的现象是否存在差异尚需进一步研究。

本研究筛选出的微卫星引物可以用于区分不同地理种群的玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂的基因型差异，为精准鉴别玉米螟赤眼蜂和螟黄赤眼蜂不同地理种群奠定了基础，同时也为进一步探寻优势种群的高效繁育与应用技术提供了理论依据。