黄连解毒汤治疗脓毒症的网络药理学研究

董青青 章怡祎 丛亿蕾 陈伟

摘要 目的：探索黄连解毒汤治疗脓毒症的核心作用靶点、主要活性成分及作用机制。方法：在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）以黄连、黄芩、黄柏、栀子为关键词分别检索，按照口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18的条件筛选，获得黄连解毒汤各中药的活性成分及其作用靶点;通过在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、GeneCards、治疗靶点数据库（TTD）检索脓毒症的疾病靶点;将预测到的成分及其疾病靶点运用Cytoscape软件进行中药-成分-疾病-靶点网络构建及分析，筛选核心靶点及主要活性成分，通过STRING数据库结合Cytoscape软件绘制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行网络拓扑学分析，通过R语言运行后对核心靶点进行基因本体（GO）分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路注释分析，设定阈值 P <0.05， Q <0.05，筛选具有显著性差异的生物过程及信号通路。结果：筛选出黄连解毒汤78个成分和841个药物靶点;这些共同靶点涉及147条生物过程包括TNF信号通路、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡通路等代谢通路，内分泌抵抗等与内分泌系统相关的通路。结论：黄连解毒汤中小檗碱、槲皮素、山柰酚等多种成分协同作用于AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等，初步揭示了其在治疗脓毒症时的多成分、多途径、多靶点协同作用的复杂机制过程，为未来实验验证奠定了理论基础。

关键词 黄连解毒汤;脓毒症;网络药理学;作用机制

Mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the Treatment of Sepsis Based on Network Pharmacology

DONG Qingqing1，ZHANG Yiyi1，CONG Yilei2，CHEN Wei1

（1 Department of Intensive Care Medicine，LongHua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2 Department of Endocrinology，LongHua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

AbstractObjective： To explore the core targets，main active components and mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of sepsis. Methods： The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was searched，with 黃连（Rhizoma Coptidis），黄芩（Radix Scutellariae），黄柏（Cortex Phellodendri），and栀子（Fructus Gardeniae） as keywords.According to bioavailability（OB）≥30% and drug-likeness（DL）≥0.18，the active components and targets of each Chinese medicinal material in Huanglian Jiedu Decoction were obtained.Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），GeneCards，and Therapeutic Target Database（TTD） were used to screen the targets of sepsis.Then the obtained predicted components and disease targets were input in Cytoscape to construct the network of Chinese medicinal material-components-disease-targets，and the core targets and main active components were screened.The protein protein interaction（PPI） network was plotted via STRING combined with Cytoscape and topological analysis was performed.After R language running，GO analysis and KEGG pathway annotation analysis were conducted on the core targets，with the thresholds of  P <0.05 and Q<0.05，to screen the biological processes and signaling pathways with significant differences. Results： A total of 78 components and 841 targets of Huanglian Jiedu Decoction were screened，and 147 biological pathways were involved，including metabolic pathways such as tumor necrosis factor（TNF），chemokine，hypoxia-inducible factor 1（HIF-1），and apoptosis signaling pathways，and pathways related to the endocrine system such as AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications and endocrine resistance. Conclusion： Berberine，quercetin，kaempferol and other components in Huanglian Jiedu Decoction synergistically acted on the AGE-RAGE signaling pathway，TNF signaling pathway，etc.，which preliminarily revealed the complex multi-component，multi-pathway and multi-target synergistic mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of sepsis，and laid a theoretical foundation for future experimental verification.E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

Keywords Huanglian Jiedu Decoction; Sepsis; Network pharmacology; Mechanism

中图分类号：R285 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.012

脓毒症（Sepsis）是严重感染、严重创伤、烧伤、休克、外科手术后常见的并发症，可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS）。以其在重症监护室中的高发病率、高病死率、高治疗费用而闻名，若并发感染性休克，病死率可高达80%[1-3]。因此结合中西医疗法的各自优势，提高治疗效果，缩短住院天数，降低其病死率，是当前迫切需要解决的科学问题。

脓毒症这一病名在中医学中并未记载，中医学者们以《伤寒论》和温病学说作为理论基础提出了脓毒症的病机体现在本虚和标实2个方面。由于发病原因和人体体质的不同，根据正邪两方面在疾病表现中所处地位，区别主次、先后，采取以扶正为主，兼顾祛邪，或以祛邪为主，兼顾扶正，随机应变，掌握机宜，达到有效改善预后的目的，为临床提供参考[4-5]。现代学者将脓毒症的证型及治法概括为“三证三法”，即毒热证与清热解毒法，瘀血证与活血化瘀法，急性虚证与扶正固本法[6]。

黄连解毒汤最早载于葛洪所著的《肘后备急方》，由黄连、黄芩、黄柏以及栀子按照3∶ 2∶ 2∶ 3的比例配伍而成。黄连解毒汤具有清热解毒之功效，用于治疗三焦火毒所致的热甚发斑、热病吐血、衄血、湿热黄疸或外科的痈疡疔毒等疾病。临床常用于治疗脓毒症、痢疾、肺炎等热毒症患者[7]。研究发现，黄连解毒汤具有显著的抗炎、抑菌、抗氧化、抗血栓及免疫调节的作用[8-10]。由此可见黄连解毒汤对脓毒症的治疗有着举足轻重的作用，但该中药复方的有效活性成分及其作用靶点和机制仍须进一步研究。本研究依托于网络药理学方法预测黄连解毒汤治疗脓毒症的潜在作用靶点及其机制，为临床干预治疗提供新的思路。

1资料与方法

1.1药物成分及靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中检索黄连解毒汤中各药物的成分作为潜在活性成分[11]，并根据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18进行筛选[12]，使用PubChem数据库获得上述成分的SDF格式化学结构，导入Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），取预测得分大于0的靶点作为药物靶点[13]。

1.2脓毒症作用靶点筛选

使用在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）以“Sepsis”为关键词进行检索，将上述3个数据库的靶点数据汇总，去重后获得疾病作用靶点。

1.3药物-疾病共同靶点的筛选

在Venny 2.1在线软件作图工具平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上输入药物靶点及疾病靶点，绘制韦恩图。

1.4中药-成分-疾病-靶点网络构建及分析

使用Cytoscape 3.7.2软件（http：//www.cytoscape.org），构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图，其中網络中节点（Node）表示黄连解毒汤的4味中药、活性成分及潜在靶点，节点之间则以边（Edge）相连。使用Network Analyzer工具计算网络拓扑参数，根据节点连接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及紧密度中心性（Closeness Centrality）对黄连解毒汤的网络拓扑结构进行分析[14-16]。

1.5蛋白质-蛋白质相关作用关系网络构建

将上述139个共同靶点输入到Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins数据库（STRING，http：//string-db.org/）[17]中进行检索，设置蛋白种类为“Homo Sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，获取靶点相互作用的网络关系数据，将其导入Cystoscap 3.7.2软件，绘制蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络图。

1.6基于拓扑分析的核心靶点筛选

将PPI网络导入Cystoscap 3.7.2中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，以Degree，Betweenness Centrality，Average Shortest Path Length和Closeness Centrality这4个参数为参考标准[18]，通过Degree排序，选取分值大于平均分的基因作为核心靶点，将前30个靶点使用R3.6.0绘制条形图。

1.7基于聚类分析的核心靶点筛选

将已经构建好的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2中，使用MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选[19-20]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

1.8靶点的生物功能及通路富集分析

利用R语言的clusterProfiler工具包[21]将基因Symbol转为基因ID，对靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）生物过程富集和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，保存結果，设定阈值 P <0.05， Q <0.05，筛选具有显著性差异的生物过程及信号通路。

2结果

2.1黄连解毒汤的潜在活性成分

查找出黄柏、黄连、黄芩、栀子的化学成分分别为黄柏37个、黄连14个、黄芩36个、栀子15个，合并后删除重复成分共得到潜在活性成分85个。使用Swiss Target Prediction数据库筛选出黄连成分作用靶点448个、黄柏成分作用靶点699个、黄芩成分442个、栀子成分373个，最后排除重复作用靶点和非人体作用靶点得到841个药物靶点。见表1。

2.2脓毒症的潜在作用靶点

将OMIM、GeneCards、TTD数据库获得的脓毒症相关药物靶点去重，共获得疾病靶点816个。将841个药物靶点、816个疾病靶点绘制韦恩图，二者取交集后获得药物-疾病共同靶点139个。见图1。

2.3疾病-成分-靶点核心网络

将黄连解毒汤中85个潜在活性成分与139个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape软件中，删除7个与疾病靶点无交集的活性成分，并绘制出“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图。图中紫色长方形代表药物，蓝色三角形代表各活性分子，绿色圆形代表靶点，红色菱形代表疾病。见图2。对网络图进行拓扑分析可以看出，一个活性成分可作用于多个靶点，作用靶点数量前5位的化合物分别为：5，2′-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮（5，2′-Dihydroxy-6，7，8-Trimethoxyflavone），5-羟基-7，8-二甲氧基黄酮（Moslosooflavone），黄芩酮Ⅱ（SkullcapflavoneⅡ），5，7，2，5-四羟基-8，6-二甲氧基黄酮（5，7，2，5-Tetrahydroxy-8，6-Dimethoxyflavone），半枝莲种素（Rivularin），这些化合物有可能在治疗脓毒症过程中起着重要的作用。见表2。

2.4PPI网络的构建及关键靶点筛选

PPI网络图共有78个靶点可发生蛋白质-蛋白质相互作用，有2 324条相互作用连接线，平均度值为33.4。根据Degree值大小进行排序，Degree值越大，说明该节点很可能就是关键成分或关键靶点。见图3～4。

2.5PPI网络聚类结果

使用MCODE插件将黄连解毒汤靶点PPI网络进行聚类分析，总共得到5个基因簇和4个核心基因，核心基因为TNFRSF1A、AGTR1、F2、CYP2C19。见表3，图5。

2.6靶点蛋白GO分析

将139个共同靶点经R语言运行，GO结果显示，黄连解毒汤治疗脓毒症共涉及2 256条生物过程（Biological Process，BP）通路，其中主要包括白细胞迁移（Leukocyte Migration）、对外界刺激的积极调节反应（Positive Regulation of Response to External Stimulus）、肽基酪氨酸磷酸化（Peptidyl-Tyrosine Phosphorylation）等。共有74条细胞组分（Cell Component，CC）表达过程，主要涉及膜筏（Membrane Raft）、膜区（Membrane Region）、细胞质囊泡腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）、肥大细胞颗粒（Mast Cell Granule）、含胶原的细胞外基质（Collagen-Containing Extracellular Matrix）等。141个与分子功能（Molecular Function，MF）相关的过程，主要集中于非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性（Non-Membrane Spanning Protein Tyrosine Kinase Activity）、磷酸酶结合（Phosphatase Binding）、蛋白质酪氨酸激酶活性（Protein Tyrosine Kinase Activity）、丝氨酸水解酶活性（Serine Hydrolase Activity）、蛋白磷酸酶结合（Protein Phosphatase Binding）。见图6～8。

2.7KEGG通路富集分析筛选出147条KEGG通路，将前20的结果绘制成条形图。这些通路包括了卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-Associated Herpesvirus Infection）、TNF信号通路（TNF Signaling Pathway）、人巨细胞病毒感染通路（Human Cytomegalovirus Infection）。见图9。

3讨论

3.1组方分析

黄连解毒汤主治三焦积热，邪火妄行，故用黄芩泻肺火于上焦，黄连泻脾火于中焦，黄柏泻肾火于下焦，栀子通泻三焦之火，从膀胱而出。盖阳盛则阴衰，火盛则水衰，故用大苦大寒之药，抑阳而扶阴，泻其亢盛之火，而救其欲绝之水，然非实热，不可轻投[7]。根据现代药理学的研究，发现黄连解毒汤具有抑制耐药性、抗氧化、抗血栓形成、降糖、调脂、保护心肌、增强免疫调节等优点，最重要的是可以抗炎，抑菌，抗内毒素及保护脑功能[22]。在现代临床研究中，黄连解毒汤被广泛应用于各种疾病的治疗中，尤其是在急性感染性疾病方面，如脓毒症、急性感染性心内膜炎、重症肛周脓肿、急性百草枯中毒、急性盆腔炎等[23]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

3.2成分分析

研究结果发现黄连解毒汤潜在活性成分的口服生物利用度高，作用靶点广泛。根据已有文献进一步分析，小檗碱作为黄连和黄柏的主要药效物质基础，其能够改善学习记忆能力、保护心肌缺血的再灌注损伤、抗糖尿病、抗炎、降脂。盐酸巴马汀具有和小檗碱相似的化学结构，能有效抗炎、抗菌、抗病毒和降血糖等[24-25]。罗煜等[26]的研究表明，盐酸巴马汀可同时作用于核因子κB/p38MAPK信号通路和NLKP3炎症小体信号通路上，最终减少炎症介质的释放，起到良好的抗炎功效。黄芩中的黄芩苷通过对icaA和cida基因表达的降低，影响细胞间多糖黏附素（PIA）的合成和细胞外DNA（eDNA）的释放，从而对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成产生抑制作用[27]。此外黄芩苷还有显著的抗炎[28]、抗病毒[29]、清除自由基[30]、抗氧化[31]、保护肾脏[32]、抑制心肌缺血[33]和免疫调节作用[34]。山柰酚为栀子中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物和心血管系统保护的作用[35]。槲皮素（Quercetin），又名栎精，是一种黄酮类化合物，具有抗氧化应激、抑菌、抗病毒、调节免疫及抗血小板聚集等药理作用[36-39]。

3.3靶点分析

根据Degree值大小排序，对排名前30位靶点根据相关文献进一步分析。其中血清白蛋白（Serum Albumin，ALB）是人类血液中最丰富的蛋白质。该蛋白在调节血浆胶体渗透压中起作用，并充当多种内源性分子（包括激素，脂肪酸和代谢产物）以及外源性药物的载体蛋白，具有抗氧化和抗炎特性，可作为活性氧[40-41]和氮[42]的清除剂，并且可作为酸碱平衡的缓冲分子[43]。感染性休克患者的特点是内皮屏障渗漏增加，ALB和高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein，HDL）显著丢失[44-45]。一磷酸鞘氨醇（Sphingosine Monophosphate，S1P）是一种重要的免疫调节剂，负责淋巴细胞的发育、T细胞和B细胞的定位和迁移以及细胞因子的分泌等生理细胞反应[46]。ALB和HDL等S1P载体分子参与了S1P效应的调控[47]。因此，脓毒症患者的S1P浓度也会降低，特别是在感染性休克患者中。

同时，一个靶分子可被不同活性成分靶向作用，如MAPK14、MPO、TLR8等。MAPK14可以参与炎症反应中细胞因子的产生，正向调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录，在脓毒症的发病过程中起到关键作用[48]。髓过氧化物酶是嗜中性粒细胞浸润的标志，是氧化应激的标志[49]。在脓毒症早期，髓过氧化物酶的产生超过人体的抗氧化防御能力，这种不平衡可以导致直接的线粒体损害，甚至能够导致器官衰竭[50-51]。此外，其他的研究表明，降低脓毒症的氧化应激可以作为一种线粒体保障策略[52-53]。因此，髓过氧化物酶可能是脓毒症的潜在治疗靶点。TLR8是Toll样受体（TLR）家族的成员，因其能够识别来自乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），人免疫缺陷病毒（HIV）和流感病毒的单链RNA（ssRNA）的能力而闻名。最近，一些研究证实，TLR8介导的RNA识别在金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌和莱姆病螺旋体感染的检测中起着至关重要的作用[54-56]。影响TLR8活性的溶酶体功能抑制对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染均具有抗炎作用，这意味着TLR8的抑制可作为脓毒症的一种潜在治疗手段[55]。

此外，本研究通过对黄连解毒汤PPI网络进行聚类分析得出了其中显著性较强的4个模块，其中模块1中包含TNFRSF1A、IL-2、TNF、TLR8、TLR7等炎症相关因子。当病原微生物入侵机体时，激活细胞因子释放炎症介质，这表明黄连解毒汤能够通过抑制炎症反应发挥治疗作用。

肾素-血管紧张素系统（Renin Angiotensin System，RAS）在脓毒症中被激活，不仅与脓毒症中的微血管功能障碍有关，还贯穿脏器功能紊乱的始终[57]。最近，Zhang等[58]已证明RAS的低表达与严重脓毒症患者的不良预后相关。血管紧张素作为RAS的重要环节，其中肾素血管紧张素Ⅱ（Renin Angiotensin Ⅱ，Ang-2）与脓毒症的炎症反应、细胞凋亡、血管渗漏等病理过程密切相关。目前相关研究表明，严重脓毒症患者的Ang-2和肾素水平升高，而升高的程度与反应性充血期间的微血管复氧率负相关[57]。模块2中的核心基因为AGTR1（AT1），AT1作为Ang-2的主要受体，大多数已知的Ang-2的作用是由AT1介导的。AT1具有调节血管收缩作用，并参与Ang-2调控炎症，研究表明AT1在脓毒症患者体内下调[59]。

通过此网络验证了黄连解毒汤治疗脓毒症是通过多成分、多靶点、共同调节的方式发挥作用的。

3.4通路结果分析

通过GO富集分析发现黄连解毒汤治疗脓毒症的78个潜在关键靶点基因的主要生物过程涉及炎症反应、氧化应激、细胞因子的分泌调节、细胞凋亡调控等。分子功能包括蛋白激酶结合、受体活性、细胞因子活性、激酶活性调控等方面;细胞组分则主要富集在细胞区域、细胞质膜和线粒体等方面。

黃连解毒汤的KEGG通路富集结果表明，其绝大部分基因富集在TNF信号通路、Toll样受体信号通路、EB病毒感染、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、甲型流感等炎症通路，破骨细胞分化通路、细胞凋亡通路等代谢通路，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗等与内分泌系统相关的通路。

众所周知，核因子κB是炎症反应中的主要转录因子，广泛的细胞外刺激如病毒、细菌和酵母产物与不同的Toll样受体（TLR）相互作用，以及TNF、IL-1分别与TNF受体1（TNFR1）和IL-1受体（IL-1R）结合均能激活核因子κB通路，以响应各种刺激[60]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

研究表明，糖基化终末产物（AGEs）能结合细胞膜上RAGE，上调炎症反应并导致组织细胞的破坏[61]，并且能够导致氧化应激和细胞功能不良，自由基产生以及核因子κB的活化[62]。核因子κB则能够诱导促进细胞因子IL-6、TNF-α、IL-α等的释放，从而引起炎症反应[63]。蔡红蝶等[64]的实验表明AGEs作用于肠道L细胞（GLUTag），通过上调细胞RAGE表达，从而激活NADPH氧化酶，升高p38MAPK磷酸化水平，促使核因子κB表达，释放炎症介质，其发病机制与本研究预测具有一致性，而黄酮类成分能显著调节GLUTag细胞中AGEs/RAGE/p38MAPK/核因子κB信号通路。但AGE-RAGE轴在导致多器官衰竭和死亡的过度炎症反应中的相关实验研究较少，本研究可为黄连解毒汤治疗脓毒症的进一步实验研究提供参考。

综上所述，本研究依托网络药理学，对黄连解毒汤治疗脓毒症的化学成分、作用靶点和相关信号通路进行系统分析和探讨，预测了黄连解毒汤中小檗碱、槲皮素、山柰酚等多种成分协同作用于AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等，初步揭示了其在治疗脓毒症时的多成分、多途径、多靶点协同作用的复杂机制过程，为未来实验验证奠定了理论基础。

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（2021-03-03收稿本文编辑：魏庆双）

基金项目：上海市重大危重医疗事件中西医协同响应与干预平台建设项目（ZY2018-2020-FWTX-7004）作者简介：董青青（1994.07—），女，硕士研究生在读，研究方向：中西医结合治疗急危重症，E-mail：sixi16602152267@163.com通信作者：陈伟（1962.07—），男，博士研究生，主任医师，博士研究生导师，研究方向：心血管和危重病的中西医结合防治，E-mail：cwdoctor@163.comE252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1