重庆地区结核分枝杆菌异烟肼和丙硫异烟胺耐药及其交叉耐药相关基因突变研究

朱大冕，刘文果，沈 静，余锋平，孔珏颖，冯 鑫，胡 彦

耐多药结核病(MDR-TB)是指体外药敏试验证实对利福平和异烟肼同时耐药的结核病。根据2020年世界卫生组织报告，2019年全球约有39万例MDR-TB患者，我国约有5.46万例[1]。异烟肼(isoniazid,INH)是结核病标准化疗方案的核心药物[2]。结核分枝杆菌(MTB)对INH耐药后，多采用丙硫异烟胺(protionamide,Pto)代替INH进行治疗。乙硫异烟胺(ethionamaide,Eto)/Pto用于MDR-TB治疗，是目前WHO推荐的MDR-TB治疗药物之一[3]。异烟肼和Eto/Pto的作用机制是抑制MTB分枝酸的合成[2]，两药存在部分交叉耐药机制[4]，inhA基因及其调控区域突变就是其主要分子机制之一[5]。

本研究将探讨MTB对INH与Pto的耐药情况，采用序列分析的方法检测INH耐药相关基因，分析INH与Pto交叉耐药相关基因inhA突变特点，为耐药基因型检测奠定基础，也为临床治疗MDR-TB提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选用2014年9月至2019年3月期间来源于重庆39个区县的233株INH耐药MTB临床分离株以及5株全敏感MTB；中国疾病预防控中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室提供标准株H37Rv。

1.2 试剂 分离培养、菌种鉴定、药敏试验所用试剂均购于珠海贝索生物技术有限公司。培养基内药物终浓度分别为：INH 0.2 μg/mL，RFP 40 μg/mL，SM 4 μg/mL，EMB 2 μg/mL，Ofx 4 μg/mL，Km 30 μg/mL，Cm 40 μg/mL，Pto 40 μg/mL，PAS 1 μg/mL，AK 30 μg/mL。

1.3 药敏试验及鉴定 药敏试验采用比例法，将稀释好的菌悬液分别接种于对照、含药及PNB和TCH培养基，37 ℃培养3～4周。根据耐药百分比判读：耐药百分比=(含药培养基生长的菌落数/对照培养基生长的菌落数)×100%。若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。

1.4 DNA提取 取适量新鲜菌苔于0.5 mL去离子水，85 ℃金属浴30 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清；0.5 mL TE缓冲液，100 ℃金属浴20 min；……