一株维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏特性研究

张凤贤　刘晓丽　李全振　王凤敏　王圆圆　蒋红艳　杨蕾

摘要：从邯郸魏县患病锦鲤（Cyprinus carpio koi）体内分离获得一株革兰氏阴性菌，对其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列进行分析，鉴定其为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）;经人工感染试验，发现菌液浓度3.0×1010CFU/mL下感染锦鲤发病，对发病锦鲤进行病原菌分离、观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA序列分析，与感染试验菌株为同一种菌。采用微量肉汤稀释法对该菌株进行药敏试验，发现其对盐酸多西环素、恩诺沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶敏感，对硫酸新霉素中度敏感。

关键词：锦鲤（Cyprinus carpio koi）;维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）;分离鉴定;人工感染;药敏试验

锦鲤（Cyprinus carpio koi）色彩艳丽、花纹多变、体格健美、泳姿雄然，是和平、幸福、长寿的象征，是一种高档观赏鱼，具有“水中活宝石”的美称。随着社会发展和人们生活水平的提高，锦鲤的市场需求越来越多，锦鲤养殖具有广阔的市场前景，但锦鲤患病严重影响养殖户的收入，制约锦鲤养殖产业的发展。虽然目前造成锦鲤大量死亡的原因以鲤浮肿病、锦鲤疱疹病毒病等病毒类疫病为主，但日益频发的细菌性疾病也给锦鲤养殖产业带来了巨大损失，如铜绿假单胞菌、气单胞菌、希瓦氏菌、少动鞘氨醇单胞菌等[1]。

气单胞菌（Aeromonas）广泛存在于江河或沿岸，是鱼类的重要病原菌，为革兰氏阴性短杆菌，主要种类有：维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、简氏气单胞菌（Aeromonas jandaei）、中间气单胞菌（Aeromonas media）和杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）等[2-3]。

自2015年以来，全国水产技术推广总站在全国包括河北省在内的十几个省连续开展“水产养殖动物主要病原菌耐药性监测”工作[4]，根据2021年河北省水产技术推广总站水产养殖动物病原菌耐药性的研究和分析，在监测地区分离得到的气单胞菌以维氏气单胞菌为主（占气单胞菌总数的92.50%），所以做好维氏气单胞菌的监测及预防研究非常重要。本研究通过对发病锦鲤体内分离得到的一株维氏气单胞菌的人工感染和药敏试验研究，为鱼类实际生产养殖过程中维氏气单胞菌感染的防治提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

LB肉汤、LB营养琼脂、细菌生化鉴定管及配套相关试剂购自青岛海博生物技术有限公司，药敏分析试剂板购自南京菲恩医疗科技有限公司，PCR相关试剂购自TakaRa公司。患病锦鲤取自河北邯郸魏县某锦鲤养殖场，健康锦鲤购自石家庄市某养殖场，体长10～13 cm。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离纯化2021年4月将邯郸魏县某锦鲤养殖场患病锦鲤带回实验室，无菌操作条件下解剖，用接种环取其肝脏、脾脏、肾脏组织，划线于LB固体培养基进行病原菌的分离培养，25 ℃，培养48 h，挑选优势菌落纯化培养3次，得到纯化菌株命名为WX-11。将纯化菌株WX-11挑取单菌落于LB液体培养基中，25 ℃，过夜振荡培养18 h，保存甘油菌（25%甘油浓度）于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2病原菌的形态和生理生化特性鉴定试验观察菌株WX-11在LB固体培养基上的菌体形态特征，并进行革兰氏染色，镜检观察;利用细菌生化鉴定管，根据鉴定管使用说明书对其进行生理生化特性鉴定。

1.2.3病原菌的16S rDNA序列分析对菌株WX-11进行基因组DNA提取，然后采用通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R： 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）进行PCR扩增，获得16S rDNA序列产物，PCR产物送派诺森生物科技有限公司进行基因测序，测序结果与NCBI Blast数据库中的序列进行比对分析，确定种属。

1.2.4人工感染试验选取健康、游动快速的锦鲤40尾，在（18±2）℃的水箱中暂养1周，养殖期间连续供氧，定时换水、投喂饲料，确认健康无病后用于人工感染试验，试验前1 d停止投喂。感染试验在58 L的塑料鱼槽中进行，控制水温（18±2）℃，日换水量70%，感染期间连续供氧，不投喂饲料，养殖污染用水经二氧化氯消毒处理后排放。

1.2.4.1菌悬液的制备接种菌株WX-11甘油菌到LB液体培养基中（接种量0.1‰），25 ℃，100 r/min，过夜振荡培养18 h;获得的菌悬液，4 ℃，8 000 r/min，离心5 min，弃上清，用无菌生理盐水（0.90% NaCl溶液）离心洗涤3次，然后将菌体沉淀用无菌生理盐水重悬，采用麦氏比浊管及平板计数校对方法，调整菌悬液浓度分别为3.0×106、3.0×108、3.0×1010  CFU/mL。

1.2.4.2感染注射采用泄殖腔注射法将制备好的各浓度（3.0×106、3.0×108、3.0×1010  CFU/mL）菌悬液注射到健康锦鲤体内进行感染试验，每尾鱼注射1 mL，每个浓度菌悬液注射10尾鱼;同时，设置对照组1组，10尾鱼，每尾鱼注射1 mL的生理盐水（0.90% NaCl）。感染各浓度及对照组锦鲤分别放入不同水槽中进行试验观察，试验期间不投喂饲料，连续供氧，每日定时换水，日换水量70%。

1.2.4.3观察和解剖试验期间，每天观察和记录各水槽中鱼体发病和水质变化情况，连续观察10 d，及时捞出死亡或濒临死亡有典型临床症状的鱼体，在无菌操作条件下解剖，对鳃、肝、脾、肾及其它内脏进行临床症状观察并拍照留存，用接种环取肝、脾、肾、鳃组织划线于LB固體培养基中，按1.2.1中的方法进行病原菌的分离纯化培养。23B3DDFF-5A1D-4415-A2CA-707364C09F19

1.2.5藥敏试验采用微量肉汤稀释法对菌株WX-11进行药敏试验，具体操作方法依照药敏分析试剂板使用说明书。

2结果与分析

2.1菌株WX-11的形态和生理生化特性

菌株WX-11在LB固体培养基中生长浅灰色圆形菌落，边缘整齐，中间微凸起，表面光滑，不透明（见封三图1）。经革兰氏染色为革兰氏阴性短杆菌（见封三图2）。

菌株WX-11的生理生化特性鉴定结果见表1。

由表可知，菌株WX-11可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖;不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚;可产生苯丙氨酸脱氨酶;有动力;不产生鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶;发酵不产生硫化氢;不产生尿素酶;不可以利用柠檬酸盐;MR、VP试验阳性。

根据《常见细菌系统鉴定手册》[5]，菌株WX-11的形态特征和生理生化特性与维氏气单胞菌高度相似。

2.2菌株WX-11的16S rDNA序列分析结果

根据测序结果，菌株WX-11的16S rDNA序列长度为1 503 bp，与NCBI Blast数据库中的序列比对分析，发现菌株WX-11与维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）的同源性大于99.0%。

综合菌株WX-11的形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，确定菌株WX-11为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。

2.3人工感染试验结果

感染WX-11菌液浓度为3.0×1010  CFU/mL的锦鲤，在感染后18 h开始出现死亡，24 h死亡率达到40%，48 h死亡率达到60%，48 h～10 d无死亡。发病锦鲤临床症状主要表现为：体表（见图2中的①②图）出血，尾鳍、背鳍、臀鳍出血，肛门红肿，腹部红肿，解剖（见图2中的③图）鳃发白，有腹水，肠道出血，肝、脾、肾出血，初步诊断为细菌性感染症状。

感染3.0×106  CFU/mL和3.0×108  CFU/mL两个浓度的锦鲤，试验期间游动情况良好、外观正常，水质良好，无死亡，试验10 d时，对感染锦鲤进行解剖，发现肝、脾、肾及肠道均出现不同程度的出血，同样呈现出细菌性感染症状。

对照组试验锦鲤游动和水质良好，未出现死亡和临床症状表现。

感染试验结果见表2。

从感染发病锦鲤体内分离得到的病原菌经LB固体培养基培养形态观察、革兰氏染色镜检、生理生化特性和16S rDNA序列分析，与感染菌株WX-11一致。

2.4药敏试验结果

根据菌株WX-11药敏试验结果，获得各药物对该菌株的最小抑菌浓度MIC，见表3。

由上表最小抑菌浓度MIC可知，WX-11对盐酸多西环素、恩诺沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶敏感，对硫酸新霉素中度敏感。

3讨论

气单胞菌为淡水鱼类的主要病原菌，广泛存在于江河或沿岸，而维氏气单胞菌作为目前河北省监测地区范围内主要气单胞菌种类，其特性的研究和防治对鱼类养殖非常重要。

研究中通过对菌株WX-11生理生化特性的研究发现该菌可分解利用甘露醇;可产生苯丙氨酸脱氨酶;有动力;不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖;不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚;不产生鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶;发酵不产生硫化氢;不产生尿素酶;不可以利用柠檬酸盐;MR、VP试验阳性。其他特性待进一步研究。

本研究中的人工感染试验说明菌株WX-11具有较强的毒力，对锦鲤的致死浓度是3.0×1010  CFU/mL，感染锦鲤后有肝、脾、肾和肠道出血等典型临床症状表现，在鱼类生产养殖过程中，当存在养殖密度过大、水污染等不利鱼类生长的情况时，鱼类机体免疫力下降，作为条件致病菌维氏气单胞菌可能会感染鱼体发病，甚至造成大量死亡。

通过研究中的药敏试验结果发现，菌株WX-11对盐酸多西环素、恩诺沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶敏感，对硫酸新霉素中度敏感。结合国务院兽医主管部门批准的水产养殖用兽药，试验结果可以合理指导水产养殖中维氏气单胞的感染预防和治疗用药，有效控制滥用药和过量用药现象的发生。

4结论

维氏气单胞菌可以感染引起锦鲤发病死亡，且具有体表、鳍出血，肛门、腹部红肿，肝、脾、肾、肠道出血等典型临床症状表现。在鱼类水产养殖生产过程中，可以利用盐酸多西环素、恩诺沙星、氟甲喹、氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶等抗生素进行维氏气单胞菌感染的鱼类疾病的防治。

参考文献：

[1] 苗淼，吕爱军，胡秀彩，等.锦鲤厦门希瓦氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].南方农业学报，2018，4（1）：172-177.

[2] 王闻卿，朱林英，郝莉鹏，等.气单胞菌研究概况[J].疾病监测，2016，31（7）：591-597.

[3] 谭爱萍.水产动物源气单胞菌耐药性与质粒介导喹诺酮类耐药研究[D].广州：华南农业大学，2016.

[4] 全国水产技术推广总站.2020年全国水产养殖动物主要病原菌耐药性监测分析报告[M].北京：中国农业出版社，2021：前言.

[5] 东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：106-119.

Isolation，identification and antibiotic susceptibility analysis

of a strain of Aeromonas veronii23B3DDFF-5A1D-4415-A2CA-707364C09F19

ZHANG Fengxian LIU Xiaoli LI Quanzhen WANG Fengmin

WANG Yuanyuan JIANG Hongyan YANG Lei1

Abstract：A Gram-negative strain of bacteria was isolated from diseased Cyprinus carpio koi from Wei County in Handan.The strain was identified as Aeromonas veronii by morphological characteristics，physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. It was found that the Cyprinus carpio koi was infected with the concentration of the strain of 3.0×1010CFU/mL in artificial infection test. The isolated pathogenic bacteria from the infected Cyprinus carpio koi were identified as the same strain as the experimental strain by morphological characteristics observation，physiological，biochemical characteristics identification and 16S rDNA sequence analysis. It was found that the strain was sensitive to doxycycline hydrochloride，enrofloxacin，flumequine，flubenicol，methanomycin，sulfamethoxazole sodium，sulfamethoxazole + trimethoprim，and moderately sensitive to neomycin sulfate.

Key words：Cyprinus carpio koi;Aeromonas veronii;isolation and identification;artificial infection;antibiotic susceptibility test

基金項目：财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（项目编号：CARS-45）;河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队（项目编号：HBCT2018180207）资助。

作者简介：张凤贤（1979-），女，硕士，研究方向：水产养殖病害防控技术。E-mail：14578673@qq.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.06.00223B3DDFF-5A1D-4415-A2CA-707364C09F19