CC10与小鼠心肌梗死后心肌纤维化的关系

黄挺，沈竹夏，段云娇，刘佳榛，冯京，孙育民，王骏

复旦大学附属静安区中心医院心内科，上海 200040

心肌梗死等冠状动脉疾病所引起的心力衰竭（心衰）是老年人生活质量下降以及死亡率上升的一个重要原因［1-2］，而心肌纤维化是引起心肌梗死后心衰的重要机制［3-4］。心肌纤维化可产生大量α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和胶原纤维，从而增加肌肉组织硬度，降低心脏收缩力，导致致命性心律失常［5］。因此，预防和逆转心肌纤维化有助于改善老年心衰患者的生活质量。目前心衰患者的治疗策略主要包括增强心肌收缩力和减少血管收缩，但尚无一种辅助方法能有效阻止或逆转心肌纤维化的发展［6］。

克拉拉细胞10-kDa 蛋白（Clara cell 10-kDa protein，CC10）是由克拉拉细胞分泌，对呼吸道炎症具有抑制作用的分泌性蛋白［7］。研究表明，CC10 与特发性肺纤维化的联系十分密切［8-9］。在特发性肺纤维化患者与成功诱导肺纤维化疾病模型的小鼠中，CC10在血清与肺组织中的含量上升［10-11］。且CC10 对特发性肺纤维化诊断的筛选和预测能提供一定有效的信息［12］，这可能与CC10 能够增强肺纤维化的基因表达有关［13］。作为一种肺纤维化的标志性蛋白，CC10 在正常心脏中也有表达［14］，但是否在心肌梗死后的心肌纤维化中也起作用尚未见报道。因此，本文将探讨CC10 与心肌纤维化之间的联系，为研究心肌纤维化提供新的切入点。

1 材料与方法

1．1 动物和试剂

SPF 级雄性C57BL／6 小鼠32 只，6～8 周龄，体质量20～25 g，自浙江维通利华公司购入，许可证号SCXK（浙）2019-0001，饲养于复旦大学实验动物科学部。实验符合复旦大学上海医学院实验动物福利伦理委员会要求（202109018S）。小鼠鼠抗CC10 购自美国Santa Cruz 公司（sc-365992）；兔抗Vimentin（VIM）购自美国Proteintech 公司（10366-1-AP）；兔抗CD68购自美国Proteintech 公司（28058-1-AP）；兔抗Cardiac Troponin T（cTnT）购自美国Proteintech 公司（15513-1-AP）；大鼠鼠抗CD31 购自北京博奥森生物技术有限公司（bs-0195R）；cy3-山羊抗小鼠购于中国赛维尔公司（GB21301）；488-山羊抗兔购于中国赛维尔公司（GB25303）；fitc-山羊抗大鼠购于中国赛维尔公司（GB22302）。

1．2 仪器

7025 型小动物呼吸机（意大利Ugo Basile 公司），R500 型动物麻醉机（深圳瑞沃德公司），Vevo2100 型动物心脏超声检测仪（加拿大VisualSonics 公司），5424R 型冷冻离心机（德国Eppendorf 公司），9700 型PCR 热循环仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），LightCycler®480 型实时定量聚合酶链式反应设备（瑞典Roche 公司）。

1．3 实验分组与造模

将实验小鼠随机分为模型组与假手术组，每组16只。模型组小鼠用异氟烷麻醉后，固定于操作台上。打开小鼠胸腔，7 -0 带线缝合针结扎冠状动脉左前降支，结扎部位位于左心耳下缘1 ～2 mm，排出胸腔内多余气体后缝合小鼠胸腔。假手术组小鼠不结扎冠状动脉左前降支，其余手术操作步骤均与模型组相同。自然复苏后，将2 组小鼠饲养于同一环境中，正常饮食。

模型建立后的第7、28 天，2 组各麻醉处死小鼠8只，收集肺与心脏组织。将模型组小鼠心脏分为3 个区域：（1）梗死区（左心室结扎线以下发生心梗的区域）； （2）边缘区（围绕在梗死区周围的一圈濒死组织）； （3）偏远区（远离梗死区的组织）。假手术组小鼠心脏分为3 个区域：（1）梗死区（左心耳下缘2 mm下的左心室区域）；（2）边缘区（围绕梗死区周围2 mm的区域）； （3）偏远区（远离梗死区的组织）。将小鼠肺组织与分离的心脏组织于-80 ℃冰箱保存。

1．4 免疫组化染色

4%多聚甲醛固定小鼠心脏，透明、脱水处理后石蜡包埋。垂直于心脏行长轴切片，切片厚度4 μm，55 ℃烘箱过夜。第2 天透明、脱水处理后，柠檬酸抗原修复缓冲液进行抗原修复，浸泡于3%H2O2中。经PBS 洗涤后，3%BSA 室温封闭30 min。将CC10 一抗1∶100稀释后，4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤切片3 次，cy3二抗1∶300 稀释后，室温孵育50 min。DAB 显色后复染细胞核，脱水、封片，显微镜观察切片。

1．5 Masson 染色

心脏切片脱蜡后，用G1006 型Masson 染液套装（中国赛维尔公司）进行染色，封片后观察并拍摄。

1．6 免疫荧光染色

心脏切片脱蜡后行抗原修复，3%BSA 室温封闭30 min，将CC10、VIM、CD68、cTnT 和CD31 一 抗1∶100稀释后，4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤切片3 次，用相应的cy3、488 和fitc 二抗1∶300 稀释后，室温避光孵育50 min，加入DAPI 复染细胞核封片。切片置于荧光显微镜下观察并采集图像。

1．7 心脏成纤维细胞培养

取1～3 d 的C57BL／6 乳鼠，麻醉处死，将其心脏取下。PBS 清洗数遍后，剪刀剪碎至1 mm 左右碎块，在37 ℃用0.1%胶原酶Ⅱ消化20 min。离心收集细胞，在含10%胎牛血清的DME／F12 中培养1.5 h，去除上清液，加入新鲜培养基继续培养已贴壁的成纤维细胞，待细胞长至培养皿底80%～90%后进行传代，取2 ～3 代成纤维细胞用于接下来的实验。

1．8 CCK-8 细胞增殖实验

将成纤维细胞按每孔6 ×103个密度接种于96 孔板中，待细胞数增长至70%～80%时，换无血清培养基饥饿过夜。加入0、1、10 μM 血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ），在含有10%血清的培养基中孵育48 h 后，使用CCK-8 无血清培养基继续孵育3 h，酶标仪在480 nm 波长处检测吸光度。

1．9 实时定量PCR（qRT-PCR）

提取心脏与成纤维细胞的总RNA，使用逆转录试剂盒（日本Takara 公司），将RNA 反转成cDNA 进行qRT-PCR。反应条件为95 ℃2 min、95 ℃15 s、60 ℃1 min扩增40 个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt进行半定量分析。见表1。

表1 引物序列

1．10 统计学分析

Image-Pro Plus 计算CC10 的表达并定量分析心肌纤维化程度；SPSS 19.0 对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 心肌梗死后CC10 的表达

与假手术组相应区域比较，模型组心肌梗死后第7 天梗死区（13.59 ±5.20）和边缘区（5.44 ±1.84）的CC10 mRNA 表达升高（均P＜0.05）；与假手术组相应区域比较，模型组心肌梗死后第28 天梗死区（22.16 ±5.01）和边缘区（10.16 ±4.02）的CC10 mRNA 表达升高（均P＜0.05），α-SMAmRNA 表达（5.23 ±0.51） 也升高（P＜0.01）。与假手术组（1.00 ±0.38）比较，模型组心肌梗死后第28 天肺内CC10 mRNA 表达（2.35 ±0.45）升高（P＜0.05）。见图1。

心肌梗死后第28 天，与假手术组［（5.93 ±1.76）%］比较，模型组［（34.54 ±3.77）%］心肌纤维化程度升高（P＜0.01）；与假手术组相应区域比较，模型组边缘区（P＜0.05）和梗死区（P＜0.01）的CC10平均光密度表达升高。见图2。

图2 CC10 在梗死区中的表达（±s，n ＝4）

2．2 CC10 在梗死区定位的细胞类型

在梗死区分别进行CC10 ＋VIM（成纤维细胞）、CC10 ＋cTnT（心肌细胞）、CC10 ＋CD68（巨噬细胞）及CC10 ＋CD31（内皮细胞）免疫荧光双染；同时进行CC10 和VIM 免疫荧光单染。结果显示，梗死区中VIM 标记细胞的CC10 细胞数略多于cTnT 标记的CC10 细胞，CC10 主要与VIM 标记的细胞共定位，少量与cTnT 标记的细胞共定位，而与CD68 和CD31 不共定位。见图3。

图3 CC10 在梗死区定位的细胞类型

2．3 CC10 在心脏成纤维细胞中的表达

与0 μM AngII（1.00 ±0.02）比较，1 μM（1.19 ±0.01）、10 μM（1.24 ±0.01）AngII 能刺激心脏成纤维细胞增殖（均P＜0.001）。与0 μM AngII（1.00 ±0.04）比较，1 μM（1.38 ±0.20）、10 μM（1.93 ±0.41）AngII 时心脏成纤维细胞内CC10 mRNA 表达增加（均P＜0.05）。见图4。

图4 CC10 在心脏成纤维细胞中的表达（±s，n ＝3）

3 讨论

小鼠冠状动脉左前降支结扎手术是研究心肌梗死后心室重构和心衰的常见模型，术后心脏的病理变化能够很好地模拟人类心肌梗死的病理表现［15-16］。此次研究对雄性C57BL／6 小鼠造模，术后发现模型组小鼠梗死区的心肌细胞大量凋亡并伴有纤维瘢痕组织生成，边缘区心肌细胞明显萎缩，这与既往的动物造模结果一致［17］。

心肌梗死后第7、28 天，与假手术组比较，模型组CC10 mRNA 在边缘区和梗死区的表达递增。伴随着α-SMAmRNA 表达在模型组梗死区增多，CC10 mRNA 的表达也在梗死区相应递增。α-SMA 是心脏成纤维细胞分泌的标志性蛋白，表现了心肌梗死后心脏成纤维细胞由于应激而出现的迁移性和增殖性，反映了心肌纤维化的严重程度［18］。通过Masson 染色，本研究发现心肌梗死后第28 天，模型组小鼠的梗死区呈阳性结果，胶原蛋白含量上升，表明心肌纤维化程度严重。免疫组化结果表明，在边缘区和梗死区的CC10 蛋白表达也递增。可见随着心肌梗死后心肌纤维化加重，CC10的表达在基因、蛋白和组织层面都逐渐上升。

心衰是心肌梗死的常见并发症［19］。心衰引起左心房压力升高，进而导致慢性肺水肿、肺功能障碍以及组织纤维化形成［20］。本研究发现，心肌梗死后第28天模型组小鼠肺内的CC10 mRNA 表达上升，这与心肌梗死后心衰造成的肺纤维化结果一致。CC10 是一种主要由肺非纤毛支气管上皮细胞所分泌的蛋白质，与肺的纤维化密切相关［7］。CC10 的表达在特发性肺纤维化中增加，CC10 阳性的浸润性细胞也同时与转化生 长 因 子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和胶原蛋白1A1（collagen type I alpha-1，COL1A1）共定位［21］。由此，推测在肺纤维化进展中，成纤维细胞也表达一定量的CC10。

心脏梗死区内主要存在的细胞有成纤维细胞、内皮细胞、存活的心肌细胞和少量的巨噬细胞等［22］。此次研究发现，梗死后第28 天部分成纤维细胞（VIM 阳性）可表达CC10。cTnT 作为心肌细胞标志物，其阳性表达的少量细胞也能同时表达CC10，但CC10 与成纤维细胞共定位更多。虽然VIM 蛋白可以识别成纤维细胞，但它同时也能识别巨噬细胞和内皮细胞［23］。本研究用CD31 与CD68 分别作为巨噬细胞和内皮细胞的标记物，与CC10 免疫荧光双染，从而区分成纤维细胞与其他细胞类型。结果显示，内皮细胞（CD31 阳性）与巨噬细胞（CD68 阳性）不表达CC10。因而推测CC10 的表达主要定位于梗死区的成纤维细胞，这与CC10 阳性浸润性细胞同时表达TGF-β1 和COL1A1 的文献报道相符［21］。

为了进一步验证CC10 与心脏成纤维细胞的关系，此次研究从新生小鼠体内提取原代心脏成纤维细胞进行体外实验。经CCK-8 检测发现，AngII 能够刺激心脏成纤维细胞的增殖。同时，成纤维细胞中CC10 mRNA 的表达也增加，说明伴随成纤维细胞的增殖，成纤维细胞内表达的CC10 也在不断增加。

综上所述，CC10 主要由梗死区的成纤维细胞表达，随着心肌纤维化程度加重与成纤维细胞增殖，CC10 表达也相应上升。伴随年龄增长，心肌梗死后心肌纤维化程度加重，老年人更容易发生心肌纤维化［24］。本研究一定程度上阐述了CC10 与心肌梗死后心肌纤维化的关系，为干预心肌纤维化提供了新的靶点，但CC10 是否促进心梗后心肌纤维化仍需进一步深入研究。