miR-145对血管平滑肌细胞生物活性及SM22α mRNA表达的作用*

曾丁邻 吴兴森 查庆春 李景辉△ 丘智煌

（1 漳州正兴医院心血管内科，漳州 363000；2 福建医科大学附属第一医院，福州 350005）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）与血管正常功能联系密切，具有较强的可塑性、可收缩及分泌功能。VSMC在正常情况下，表现为收缩型，只有在血管受到损伤或受到一些生物刺激时会转化为合成表型，VSMC增殖和迁移[1-4]，并分泌细胞外基质，导致血管壁增厚。高血压等增殖性血管疾病中均存在VSMC的表型转换。miR-145是一种小RNA分子[5]。研究表明miR-145与VSMC表型转换联系甚密[6]。VSMC增殖会使细胞外的分泌物增加，肌动蛋白减少[7]。另外，miR-145表达量的增多或减少可使VSMC发生分化或凋亡[8]。在血管壁，miR-145主要集中于VSMC中，在成纤维细胞中的表达极少[9]。SM22α又称转凝蛋白，为VSMC的特异性蛋白，是细胞衰老的标志物，在VSMC中发挥重要的作用[10-11]。目前，miR-145对VSMC、SM22α的作用研究较少，因此，本研究探讨miR-145对VSMC生物活性的影响以及对SM22α表达的作用。

1 材料和方法

1.1 实验分组

VSMC来自湖南丰辉公司，实验分为3组，增殖VSMC组（增殖组）、增殖VSMC+转染miR-145-NC组（空载体组）和增殖VSMC+转染miR-145模拟物组（增殖转染组）。

1.2 实验试剂与器材

胎牛血清购自郑州德宁生物公司；RPMI 1640培养液购自海门市春博实验器材公司；MTT溶液购自上海樊克生物公司；流式细胞仪购自上海实维试验器材公司；酶标仪购自南京德铁实验器材公司；胰蛋白酶购自济南允诚生物公司；Primer 5.0 软件购自广州伯信生物科技公司。

1.3 细胞的培养及增殖

RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清）于37.2℃，5%CO2条件下培养，常规传代，取第3代细胞进行实验，然后将其调整为浓度1×108个/L接种于培养瓶（52 mL）中，RPMI 1640培养液培养24 h，换含100 μg/L IL-1的RPMI 1640培养液培养2 d后传代，细胞密度为1×105个/mL，重复培养1 d后，更换无血清培养液后再培养1 d，PBS清洗，进行实验。

增殖转染组miR-145的转染：将细胞接种于6孔板内，至细胞到65%汇合时，用lipofectamineTM2000转染50 nmol/L相应的RNA mimics，继续培养3 d后即可进行后续实验。 空载体组转染miR-145-NC空载体，增殖组常规培养。

1.4 RT-PCR检测各组VSMC中SM22αmRNA、miR-145的表达

TRIzol法提取各组VSMC细胞总RNA，Primer 5.0 软件设计合成引物。 将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，PCR 反应条件： 94℃ 5 min； 94℃3 min 、56℃ 1 min、72℃ 1 min，72℃ 5 min，终止反应。取PCR产物（5 μL）进行电泳分析（琼脂糖凝胶1.5%）。以GAPDH为内参，共40个循环，计算方法用2-△△Ct法进行分析，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 免疫印迹检测细胞周期调控相关蛋白cyclin E、细胞周期依赖性抑制蛋白p27蛋白水平

将各组VSMC进行裂解，提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，-20℃保存。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4：1的比例进行，将蛋白溶液煮沸变性，电泳后转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭60 min。一抗按1：150稀释后孵育过夜，后TTBS漂洗，10 min/次，共3次；二抗稀释，封闭60 min，将PVDF膜取出后重复上述漂洗，DAB显色后照相，计算其蛋白表达含量。

1.6 Transwell小室检测VSMC侵袭能力

将增殖组、空载体组组、增殖转染组细胞（1×105个/mL）接种于6孔板中，将50 mg/L的基质胶稀释后加入小室上层，37℃呈凝胶状态，上室中加入细胞悬液，下室中加入少量胎牛血清培养基，37.5℃，培养2 d，取出培养基，拭去残留细胞，现配结晶紫，每孔500 μL，将小室放入，25℃染色30 min，PBS清洗1次，稍晾干。显微镜观察，每个样本连续选5个清晰视野进行数量统计，然后计算平均数。

1.7 MTT检测VSMC活力

将各组VSMC细胞密度调整为6×103个/mL接种到96孔板中，37.2℃、5% CO2培养箱培养，当细胞的密度培养到50%时，更换培养基，24 h后加人MTT培养4 h，使用酶联免疫检测仪测每孔在12、24、48、72 h 4个时间点的吸光度 （A） 值。

1.8 流式细胞仪检测VSMC凋亡率

胰酶消化各组VSMC，完全培养基终止；PBS清洗，310 g离心5 min后弃上清，Binding Buffer（结合缓冲液） 500 μL重 悬，Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL混匀，常规孵育10 min，流式细胞仪检测。

1.9 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，增殖组、空载体组、增殖转染组3组的SM22α mRNA 的表达、VSMC活力、增殖等结果采用±s表示，行方差分析检验（单因素分析采用单因素方差分析，不同时间点比较采用重复测量方差分析），组间两两比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组VSMC SM22αmRNA、miR-145的表达

增殖组VSMC细胞中SM22α mRNA、miR-145水平与空载体组数值差异无统计学意义（P＞0.05）；与增殖组及空载体组相比，增殖转染组miR-145、SM22α mRNA表达显著升高（P＜0.05），说明miR-145转染成功，还可上调SM22α mRNA表达（图1）。

图1 各组SM22α mRNA、miR-145水平对比

2.2 Cyclin E、p27蛋白水平

增殖组VSMC中cyclin E、p27蛋白水平与空载体组cyclin E、p27蛋白水平相比无差异（P＞0.05）；增殖转染组cyclin E蛋白水平低于其他2组（P＜0.05），p27蛋白水平高于其他2组（P＜0.05），组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明转染miR-145模拟物可降低cyclin E蛋白表达，促进p27蛋白表达（图2）。

图2 各组cyclin E、p27水平的比较

2.3 VSMC迁移能力

增殖组VSMC迁移数量（92.34±8.71）个与空载体组细胞迁移数量（89.75±8.82）个相比无差异（P＞0.05）；增殖转染组细胞迁移数量（49.83±4.56）个明显低于其他2组，组间比较差距有统计学意义（P＜0.05），说明转染miR-145模拟物可抑制VSMC侵袭（图3）。

图3 各组VSMC迁移数量对比

2.4 VSMC活力

增殖组与空载体组VSMC在不同时间点的OD值均较为接近（P＞0.05）；增殖转染组OD值在不同时间点均低于其他2组（P＜0.05），说明转染miR-145模拟物可抑制VSMC增殖（表2）。

表2 各组VSMC在不同时间点的OD值比较（±s）

表2 各组VSMC在不同时间点的OD值比较（±s）

*P＜0.05 vs增殖组； #P＜0.05 vs空载体组

组别 12 h 24 h 48 h 72 h增殖组 0.87±0.07 0.95±0.11 1.23±0.14 1.45±0.31空载体组 0.86±0.06 0.93±0.10 1.21±0.12 1.42±0.29增殖转染组 0.54±0.04*# 0.59±0.07*# 0.63±0.06*# 0.68±0.09*#F 62.79 27.29 55.60 18.18 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 VSMC凋亡率

增殖组VSMC凋亡率（2.43±0.33）%与 空载体组VSMC凋亡率（2.54±0.24）%数值接近，组间比较无差异（P＞0.05）；增殖转染组VSMC凋亡率（9.47±0.96）%较其他2组升高（P＜0.05）（图4）。

图4 各组VSMC凋亡情况

3 讨论

VSMC的增殖会导致高血压等疾病发生[12]。血管内皮功能受到损伤会使生长因子等的表达发生异常，激活细胞内信号转导通路，使VSMC增殖，产生血管疾病[13]。miR-145在VSMC表型调节过程中具有重要作用，且VSMC在多种血管病疾病中均有参与[14]。有关研究表明，狼疮性肾炎肾内血管中膜增厚时，显示VSMC发生增殖，检测miR-145后发现其表达异常[15]。miR-145在正常VSMC中含量较为丰富，可调控VSMC的表型扩张或收缩[16]。本研究主要对miR-145在血管平滑肌中的作用以及对SM22α的影响进行分析。SM22α mRNA、miR-145在增殖组与空载体组中水平较低，通过转染miR-145的模拟物后，SM22α mRNA、miR-145的水平有所升高。miR-145定位在5号染色体上，早期研究主要集中在miR-145与癌症发生、发展的关系，而近年有关研究发现，miR-145是VSMC表达最丰富的miRNA，而且大部分聚集在VSMC[17]。在血管受到损伤时，VSMC表型由收缩型转为合成型，血管重构，血管管腔变窄。VSMC的表型转化过程涉及多个基因和蛋白质因子的调控。多项研究提示miR-145表达水平在VSMC表型转化过程中起关键性作用，在原代VSMC中miR-145水平较高，随着VSMC表型转化miR-145表达下降。金成吉等[18]研究提示通过提升miR-145的水平可抑制VSMC增殖及侵袭，其作用机制与细胞增殖相关的基因有关。另外，miR-145还可能通过调节SM22α的水平促使合成型的VSMC向收缩型转化。SM22α是VSMC表型标志基因，启动子序列短，由多肽链和201个氨基酸残基组成，在VSMC中SM22α异常表达会使炎症增加，收缩功能产生障碍。SM22α在收缩型VSMC大量表达，在合成型中几乎无表达。沈凤等[19]提示促进SM22α的表达可抑制VSMC的增殖与迁移，对VSMC收缩型向合成型转化具有一定的抑制作用。陈卫国[20]等在对肺动脉高压形成的研究中提出，提高miR-145水平可促进SM22α的表达，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖，改善病情严重程度。本研究结果与上述研究结果相似，因此推测经过转染miR-145后，可能是通过促进VSMC表型标志基因SM22α水平的增加，从而抑制VSMC的活力，促使合成型VSMC向收缩型转化。

本研究结果显示，增殖组与空载体组中cyclin E水平较高、p27水平较低，经过转染miR-145的模拟物后cyclin E水平降低、p27水平升高。cyclin E是细胞周期的正调控因子，激活相应的细胞周期素依赖激酶（CDK），并加强其对底物的作用，驱动细胞由G1期向S期转换；cyclin E高表达可致细胞周期调节失控，细胞过度增殖；p27是细胞周期素依赖激酶抑制蛋白，G1后期所形成的cyclin E/CDK2复合物与p27结合，p27通过其C-末端抑制CDK2磷酸化，使其灭活，从而致细胞停滞在G1期，停止生长。p27几乎抑制所有的cyclin/CDK复合物活性，在细胞增殖、凋亡中发挥重要作用。miRNA通过调控体内蛋白编码序列表达，参与生物体的生长、发育、衰老及凋亡的调控过程。近年来，miRNA对细胞以及干细胞分化的影响受到极大的关注。有关研究提示[21]，在胚胎干细胞和成体干细胞中超过100种miRNA差异性表达，miR-145可以抑制人胚胎干细胞的多能性因子，通过降低cyclin E和间接激活分化期间的p27水平，有助于调节胚胎干细胞的细胞周期。王建新[22]等提示通过抑制cyclin E的水平，促进p27的水平可抑制VSMC细胞周期及增殖。本研究结果与上述研究结果相似，因此推测miR-145可能是通过促进SM22α水平增加影响cyclin E、p27的水平，抑制血管平滑肌细胞的周期发展。

本研究结果提示，经过转染miR-145的模拟物后，VSMC迁移数量及增殖均有所下降。当血管受到损伤后，VSMC由分化状态转化为未分化状态，这一过程使VSMC获得增殖与迁移能力，是各种增殖性心血管疾病发生发展的关键因素[23]。本研究与沈凤等[24]研究结果相似，miR-145水平升高后通过促进SM22α水平可抑制VSMC的增殖、迁移。

综上所述，过表达miR-145通过促进SM22α水平增加，抑制血管平滑肌细胞的增殖，并促进其凋亡。