1H-MR波谱检测腓肠肌细胞内脂质浓度用于早期诊断2型糖尿病模型大鼠周围神经病变

梁晓莹，肖叶玉，廖中曦，陈 杰，刘燕飞

(1.汕头大学医学院第二附属医院影像科，广东 汕头 515041；2.广州市中西医结合医院影像科，广东 广州 510800；3.益阳市中心医院影像科，湖南 益阳 413000)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 常见慢性并发症之一，发病隐匿、早期症状不明显，易被忽视而增加足溃疡及截肢等风险[1]。建立能够较好模拟DPN发生的稳定动物模型并进行研究对于早期诊断DPN具有重要临床意义，但目前罕见与高血糖及糖基化终末产物等因素有关且适用于实验室的DPN动物模型[2]。1H-MR波谱(MR spectroscopy, MRS)具有无创、可动态检测活体细胞内代谢变化及在分子水平反映生理功能和病理改变等优势，为近年研究热点之一[3]。本研究建立2型DM(type 2 DM, T2DM)大鼠模型，通过单体素1H-MRS检测大鼠右后肢腓肠肌肌细胞内脂质(intramyocellular lipid, IMCL)浓度，观察其用于早期诊断DPN的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只4周龄无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雄性SD大鼠，体质量100～120 g，由汕头大学医学院动物实验中心[许可证号：SYXK(粤)2012-079)]提供。本研究获汕头大学医学院动物伦理委员会批准(SUMC 2017-146)。

1.2 主要试剂及仪器 链脲佐菌素(streptozotocin, STZ，购自Sigma-Aldrich)，高糖高脂饲料(蛋白质∶糖∶脂肪=15.4∶53.5∶31.1，北京博泰宏达生物技术有限公司)，柠檬酸、柠檬酸钠(西陇科学股份有限公司)；7.0T小动物MR成像仪(美国Agilent公司)；BL-420生物信号采集和处理系统(成都泰盟软件有限公司)。

1.3 建立T2DM大鼠模型 将30只SD大鼠随机分为DM组(n=15)和正常组(n=15)，均以普通饲料适应性饲养1周；之后对DM组以高糖高脂饲料、正常组以普通饲料饲养4周。动物停饲、不禁饮16 h后，经腹腔注射1% STZ柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液45 mg/kg体质量。于注射后第1、3及7天分别检测2组大鼠空腹血糖，以3次均<7.5 mmol/L为正常，DM组以3次均≥16.7 mmol/L为建立T2DM大鼠模型成功；期间对DM组以高糖高脂饲料继续饲养，正常组则以普通饲料饲养。建模成功后，每周测量并记录2组大鼠空腹血糖及体质量。

1.4 单体素1H-MRS 分别于建模成功后第4、8周行7.0T单体素1H-MRS扫描。麻醉并俯卧位保定大鼠于扫描槽，以手术胶带及自制海绵垫固定其右后肢，将射频线圈置于大鼠右后肢腓肠肌区，并以手术胶带固定线圈，采集大鼠右后肢轴位及矢状位T2WI，范围包括右后肢全段，参数：TR 3 000 ms，TE 40 ms，层厚2 mm，层间距0.1 mm；之后于轴位T2WI显示大鼠右后肢内侧腓肠肌最大面积层面放置波谱感兴趣体积(volume of interest, VOI)，体素5 mm×5 mm×5 mm(图1)，采用点分辨选择波谱(point resolved selective spectroscopy, PRESS)序列采集波谱，扫描范围同上，参数：TR 2 500 ms，TE 14 ms，Average 300，手动完成匀场及水抑制扫描。采用频谱定量分析软件LC-Model拟合1H-MRS数据，并检测大鼠右后肢腓肠肌IMCL浓度。

图1 SD大鼠右后肢腓肠肌单体素1H-MRS图示VOI(红框) A.轴位； B.矢状位

1.5 电生理检测及病理观察 建模成功后第8周处死动物，分别对2组行离体右坐骨神经电生理检测及HE染色。电生理检测包括运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity, MNCV)和感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity, SNCV)，均为单刺激，延时100 ms，波宽1 ms，波间隔10 ms，频率10 Hz，强度1 V。完成电生理检测后，取长约1 cm右坐骨神经浸泡于10%甲醛溶液中，固定48 h后进行洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片及HE染色等步骤，于光镜下观察神经组织变化并拍照记录。以DM组电生理检测及镜下均示明显异常为建立T2DM DPN大鼠模型成功。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，行独立样本t检验，比较组间IMCL浓度、空腹血糖、体质量、坐骨神经MNCV及SNCV；采用配对样本t检验比较组内不同时期IMCL浓度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空腹血糖及体质量 对DM组大鼠均成功建立T2DM模型；建模成功后第4周3只大鼠死亡、第8周再死亡5只。正常组大鼠实验期间均未死亡。

建模后DM组大鼠各周空腹血糖均高于正常组(P均<0.01，图2A)。实验期间2组大鼠体质量均呈上升趋势，且DM组升高更显著，各周DM组大鼠体质量均高于正常组(P均<0.05，图2B)。

图2 建模成功后DM组与正常组大鼠每周空腹血糖(A)及体质量(B)变化趋势图

2.2 右后肢腓肠肌IMCL浓度 建模成功后第4、8周，DM组大鼠右后肢腓肠肌IMCL浓度均显著高于正常组(P均<0.01)，且建模成功后第8周DM组及正常组大鼠IMCL浓度均明显高于第4周(P均<0.01)。见表1及图3、4。

表1 建模成功后第4、8周T2DM与正常大鼠右后肢腓肠肌IMCL浓度比较(mmol/L)

图3 建模成功后第4周大鼠右后肢腓肠肌1H-MRS拟合图 A.DM组； B.正常组 (EMCL：肌细胞外脂质) 图4 建模成功后第8周大鼠右后肢腓肠肌1H-MRS拟合图 A.DM组； B.正常组

表2 建模成功后第8周T2DM与正常大鼠右坐骨神经MNCV及SNCV比较(m/s)

2.3 右坐骨神经 建模成功后第8周，DM组大鼠右坐骨神经MNCV及SNCV均明显小于正常组(P均<0.001)，见表2；病理结果示DM组大鼠右坐骨神经神经纤维基本连续、完整，排列分布尚均匀，部分神经纤维排列略稀疏，髓鞘着色稍浅、欠均匀，轴索形态尚可；同期正常组大鼠均未见明显异常(图5)。

图5 建模成功后第8周大鼠右坐骨神经病理图(HE，×20) A.DM组； B.正常组

3 讨论

近年来，DM发病率逐年上升，其中约50%可发展为DPN，严重影响预后及生存质量[4-6]。目前对于建立T2DM向DPN发展的动物模型的具体饲养时间及STZ剂量均无统一标准。本研究以高糖高脂饲养大鼠4周诱导胰岛素抵抗，并单次经腹腔注射1% STZ溶液(45 mg/kg体质量)建立T2DM大鼠模型[7-8]，建模成功率100%，且建模成功后第8周可见DPN，但此时DM组存活大鼠少于半数(7/15)，提示该模型更适用于诊断及防治DPN早期等研究。

临床主要根据症状及体征诊断DPN，主观性强，且难以实现量化。神经电生理检查及皮肤表皮内神经纤维活检等已用于评估周围神经损伤，但前者成本高、耗时，且多针对有髓大神经纤维，而早期DPN主要累及小神经纤维及神经末梢[9]，皮肤表皮内神经纤维活检则因其有创而难以广泛开展。IMCL在肌肉代谢中起重要作用，可反映脂质代谢及多种疾病的病理生理学改变，如糖尿病、肥胖症和胰岛素抵抗等[10]。传统方法主要通过肌肉组织活检及生化分析定量检测IMCL，难以实现IMCL与肌细胞外脂质(extramyocellular lipid, EMCL)完全分离，且有创，不适用于重复检测[11]。MRS可根据MR化学位移作用分析原子核及其代谢物，在体定量检测生物组织内代谢变化，且无创、无辐射。既往研究[12-13]表明，1H-MRS可用于肌肉相关研究，且能准确区分IMCL与EMCL。本课题组前期研究[14]亦发现1H-MRS可用于早期观察DM大鼠腓肠肌代谢物改变。有学者[15]指出，腓肠肌IMCL与糖尿病胰岛素抵抗密切相关。

本研究采用1H-MRS观察T2DM大鼠右后肢腓肠肌IMCL浓度，并分析其对早期诊断DPN的价值。建模成功后第4、8周，DM组大鼠右后肢腓肠肌IMCL浓度均显著高于正常组，且第8周DM组及正常组大鼠IMCL浓度均明显高于第4周，可能与胰岛素抵抗随DM进展而加重、脂肪酸氧化减少、线粒体功能障碍有关[16]，而正常组大鼠IMCL浓度升高可能系因体质量增加引起骨骼肌内异位脂肪堆积，诱导体内胰岛素抵抗，导致IMCL增多[10]，与既往研究[16-17]所见基本相符。此外，本研究发现，建模成功后第8周，DM组大鼠右坐骨神经MNCV及SNCV均明显小于正常组，且病理结果示DM组大鼠右坐骨神经神经纤维基本连续、完整，排列分布尚均匀，部分神经纤维排列略稀疏，髓鞘着色稍浅、欠均匀，轴索形态尚可。以上结果为T2DM DPN胰岛素抵抗及脂毒性学说等[18]提供了间接支持。

本研究的主要不足：①DM组大鼠死亡率较高，不适用于研究中晚期DPN；②IMCL分析为活体连续检测，而DPN为离体检测，未能对二者进行相关性分析。

综上所述，1H-MRS检测腓肠肌IMCL对早期诊断T2DM大鼠DPN具有一定价值。