黄芩苷通过调控miR-451对高糖诱导滋养层细胞损伤的保护作用

田雨青， 任宏丽*， 梁阿娟

(1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海市同济医院，上海 200065)

妊娠期糖尿病是妊娠期发生的一种严重疾病，其中超重、肥胖、高龄产妇等是关键危险因素[1]。该病是指在妊娠期发生或首次发现的对糖耐受性降低，会出现早产、流产、巨大儿等，对母婴健康带来严重影响[2]。滋养层细胞是胚胎发育而来的，可以直接与子宫内膜的细胞接触，在维持胚胎早期着床、母胎物质交换和排除代谢物等方面具有重要的作用，若滋养层细胞发生异常则易引起流产、早产等[3-4]。

黄芩苷是从黄芩中提取出的黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抑菌、利尿等活性[5]，可降低妊娠期大鼠模型的血压、尿蛋白，其作用机制与sFIT-1、PLGF表达有关[6]；能抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导人早孕绒毛细胞滋养层细胞的凋亡，但在高糖环境下的研究尚不明确[7]。miRNA是非编码RNA，广泛参与多种疾病的发展，包括妊娠期糖尿病[8]。梁小娟等[9]报道，它在妊娠期糖尿病患者外周血中表达上调，与胰岛素抵抗指数呈正相关。本实验在高糖环境下体外培养人绒毛膜滋养层细胞，探讨黄芩苷通过调控miR-451影响高糖诱导滋养层细胞的活力、凋亡和氧化应激。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo购于美国ATCC典藏中心。胎牛血清、DMEM培养基购于上海语纯生物科技有限公司；葡萄糖购于美国Sigma公司；黄芩苷购于南京青泽医药有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-451、miR-NC、miR-451购于上海吉玛制药有限公司；Lipofectamine 3000试剂盒、Trizol试剂盒购于美国Thermo Fisher公司；CCK8试剂盒、凋亡试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；cleaved-caspase3抗体、Bax抗体、GAPDH抗体购于英国Abcam公司；辣根过氧化酶标记的二抗购于武汉博士德生物工程有限公司；LDH、MDA、SOD试剂盒购于南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于日本TaKaRa公司；引物购于广州锐博生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 从液氮内取出人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基内，置于培养箱中，在37 ℃、5% CO2下每2 d换1次培养液，当细胞生长状态融合至80%时，加入胰酶消化培养。

1.3 分组及给药 取对数生长状态良好的人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，用5.5、25 mmol/L葡萄糖处理，作为对照组和高糖组；用含25、100 μmol/L黄芩苷和25 mmol/L葡萄糖处理细胞，作为高糖+黄芩苷低、高剂量组；将anti-miR-NC和anti-miR-451转染人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo后进行高糖处理，作为高糖+anti-miR-NC组、高糖+anti-miR-451组；将miR-NC和miR-451转染人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo后，采用25 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L黄芩苷处理细胞，作为高糖+黄芩苷+miR-NC组、高糖+黄芩苷+miR-451组。参照Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行细胞转染，48 h后收集细胞，进行后续实验。

1.4 CCK8检测细胞活性 取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，重悬后接种在96孔细胞板中，培养48 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，室温下反应2 h，在450 nm波长处检测吸光度，计算细胞活性。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，接种在6孔细胞板中，离心后除去上清，加入400 μL结合缓冲液吹打后加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，避光反应15 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blot检测cleaved-caspase3、Bax蛋白表达 取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，加RIPA蛋白裂解液提取总蛋白并检测浓度，100 ℃煮沸变性5 min，取40 μg在SDS-PAGE上进行电泳分离处理，转膜，加入脱脂奶粉封闭培养2 h，加入cleaved-caspase3、Bax、GAPDH抗体，在4 ℃下过夜培养，洗膜3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温培养2 h，洗膜3次，加入ECL发光液，显影，以GAPDH为内参，采用Image J软件扫描分析蛋白条带的灰度值。

1.7 试剂盒检测MDA水平及LDH、SOD活性 取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，清洗后加入裂解液，离心取细胞上清液，参照相关试剂盒说明书分别检测MDA水平及LDH、SOD活性。

1.8 RT-qPCR检测miR-451表达 取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，加入Trizol试剂进行总RNA提取，采用分光度计检测260、280 nm波长处RNA浓度，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，将cDNA灭活后参照荧光定量试剂说明进行PCR扩增，以U6为内参，采用2-ΔΔCT法检测miR-451表达。miR-451正向引物序列5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3′，反向引物序列5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物序列5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

2 结果

2.1 不同浓度黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞活性和凋亡的影响 与对照组比较，高糖组细胞活性降低(P<0.05)，细胞凋亡率、cleaved-caspase3和Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+黄芩苷低、高剂量组细胞活性升高(P<0.05)，细胞凋亡率、cleaved-caspase3和Bax蛋白表达降低(P<0.05)，见图1、表1。

图1 各组细胞凋亡率(A)、凋亡相关蛋白(B)(Ⅰ)

表1 不同浓度黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞活性和凋亡的影响

2.2 不同浓度黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞氧化应激的影响 与对照组比较，高糖组细胞LDH活性、MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+黄芩苷低、高剂量组细胞LDH活性、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞氧化应激的影响

2.3 不同浓度黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞miR-451表达的影响 与对照组比较，高糖组细胞miR-451表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+黄芩苷低、高剂量组细胞miR-451表达降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组细胞miR-451表达比较

2.4 干扰miR-451对高糖诱导滋养层细胞活性和凋亡的影响 与高糖+anti-miR-NC组比较，高糖+anti-miR-451组细胞miR-451表达、细胞凋亡率及cleaved-caspase3、Bax蛋白表达降低(P<0.05)，细胞活性升高(P<0.05)，见图2、表4。

表4 干扰miR-451对高糖诱导滋养层细胞活性和凋亡的影响

图2 各组细胞凋亡率(A)、凋亡相关蛋白(B)(Ⅱ)

2.5 干扰miR-451对高糖诱导滋养层细胞氧化应激的影响 与高糖+anti-miR-NC组比较，高糖+anti-miR-451组细胞LDH活性、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，见表5。

表5 干扰miR-451对高糖诱导滋养层细胞氧化应激的影响

2.6 黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞活性、凋亡、氧化应激的影响 与高糖+黄芩苷+miR-NC组比较，高糖+黄芩苷+miR-451组细胞miR-451表达、细胞凋亡率、LDH活性、MDA水平及cleaved-caspase3、Bax蛋白表达升高(P<0.05)，细胞活性、SOD活性降低(P<0.05)，见图3、表6。

图3 各组细胞凋亡率(A)、凋亡相关蛋白(B)(Ⅲ)

表6 黄芩苷对高糖诱导滋养层细胞活性、凋亡、氧化应激的影响

3 讨论

糖代谢异常是妊娠期糖尿病发生的主要原因，高糖能够使滋养层细胞、心肌细胞等发生凋亡，抑制细胞的增殖[10]。高糖处理滋养层细胞，能够使滋养层细胞的微绒毛排列紊乱和出现破坏、疏密不均等现象[11]，促进滋养层细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应[12-13]。本研究中用25 mmol/L葡萄糖处理人绒毛膜滋养层细胞，抑制细胞的活力，促进细胞的凋亡率，上调cleaved-caspase3和Bax蛋白表达，LDH活性、MDA水平升高，SOD活性降低。黄芩具有泻火排毒、止血和安胎等功效，黄芩苷是从黄芩内提取分离的黄酮类化合物，在抗炎、抗氧化、降血压等多种药理活性[14]。人早孕绒毛滋养层细胞经过TNF-α处理后，黄芩苷促进滋养层细胞细胞的增殖，效果优于黄芩水提取物[15]。黄芩苷能够抑制TNF-α诱导的人蜕膜细胞的凋亡，促进细胞增殖[16]。本研究选取25、100 μmol/L黄芩苷作用人绒毛膜滋养层细胞后，促进高糖诱导的细胞活性，抑制细胞凋亡率，下调cleaved-caspase3和Bax蛋白表达，LDH活性、MDA水平降低，SOD活性升高，说明黄芩苷能够减缓高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞的凋亡和氧化应激，促进细胞的活力。

miRNA是一种高度保守的单链非编码RNA分子，通过调控下游mRNA，参与滋养层细胞的增殖、凋亡等多种生物学作用[17]。Zhou等[18]研究显示，miR-384在胚胎和血浆、滋养细胞HTR-8/SVneo中表达上调，miR-384通过靶向负调控PTBP3能够抑制滋养细胞HTR-8/SVneo的增殖。曹文超等[19]研究显示，过表达miR-205-5p在滋养层细胞HTR-8/Svneo中表达上调，过表达miR-205-5p可以抑制滋养层细胞HTR-8/Svneo的增殖和侵袭，促进细胞的凋亡。本研究显示，高糖处理人绒毛膜滋养层细胞后，miR-451表达上调，经过25、100 μmol/L黄芩苷处理后，miR-451表达下调，干扰miR-451能够促进高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞的活力，抑制细胞凋亡和氧化应激。过表达的miR-451部分恢复，说明黄芩苷可能通过调控miR-451减缓高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞氧化损伤。

综上所述，高糖条件下miR-451表达上调，黄芩苷能够通过下调miR-451的表达减缓高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞的凋亡和氧化应激，促进细胞的活力，起到保护细胞的作用。