枸杞多糖对BaP诱导人绒毛外滋养层细胞凋亡和侵袭的影响

张翠翠， 李永川， 孙文萍

(青海红十字医院产科，青海 西宁 810000)

近年来，空气污染导致的胚胎发育异常已经成为国内外研究的热点。苯并芘(BaP)广泛存在于空气和水中，属于多环芳烃类化合物，BaP是一种常见的空气污染物，能够引发早产、胎儿生长受限等不良妊娠[1-2]。绒毛滋养层细胞是胎盘功能发挥和胚胎成功着床的主要因素，而其过度凋亡和侵袭受阻是不良妊娠发生的关键[3]。枸杞多糖是枸杞的有效成分，是由酸性杂多糖、多肽、蛋白质组成的复合多糖，具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等功效[4]。研究表明，枸杞多糖能够保护生殖系统，可减轻氧化损伤并促进绒毛滋养层细胞生长和分泌人绒毛膜促性腺激素[5]。目前，枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡和侵袭的影响尚不明确。本实验以人绒毛膜滋养层细胞为体外研究对象，通过流式细胞术、Transwell小室探讨枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡和侵袭能力的影响，以期为枸杞多糖在不良妊娠中的作用提供参考。

1 材料

1.1 细胞 人绒毛膜滋养层细胞购自上海弘顺生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；苯并芘(BaP)购自无锡美赞化学品有限公司；基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体、p65抗体购自武汉友联特生物技术有限公司；p65激活剂佛波酯(PMA)购自美国Sigma公司。枸杞多糖(纯度90%)购自北京索莱宝科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞分组与处理 人绒毛膜滋养层细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，培养条件为37 ℃、5% CO2。人绒毛膜滋养层细胞分为对照组、模型组及枸杞多糖低、中、高剂量组，对照组细胞不做处理；模型组细胞用含20 μmol/L BaP的细胞培养液进行培养；枸杞多糖低、中、高剂量组细胞分别用含20 μmol/L BaP和80、160、240 μg/mL枸杞多糖的细胞培养液进行培养。

2.2 流式细胞术测定细胞凋亡 培养24 h后，收集各组细胞，用PBS溶液将各组细胞密度调整为1×106/mL，吸取1 mL细胞悬浮液，1 000×g离心10 min，弃上清，在细胞中添加500 μL Binding buffer溶液，充分混合，添加PI、Annexin V-FITC染色液各5 μL，避光孵育20 min，用流式细胞仪检测凋亡。

2.3 Transwell小室检测细胞侵袭能力 首先将8 μm Transwell小室放入24孔板中，每孔中添加300 μL不含血清的细胞培养液，室温孵育30 min，弃培养液，用不含血清的细胞培养液调整细胞密度为1×105/mL，在Transwell小室的下室中加入500 μL含10%胎牛血清的细胞培养液，然后在上室中加入200 μL细胞悬液，培养24 h后，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色20 min，PBS洗涤小室3次，显微镜下观察细胞穿膜数目即为细胞侵袭数目，随机选择5个视野，取平均值。

2.4 Western blot检测MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表达

培养24 h后，收集各组细胞，加入细胞裂解液，转移到1.5 mL EP管中，置于冰上超声粉碎，4 ℃裂解30 min，15 000×g离心10 min，吸取上清，即为细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。配制5%上层浓缩胶和10%下层分离胶，每孔蛋白上样量为30 μg，100 V恒压电泳，90 V转膜90 min。将PVDF膜取出并放在5%牛血清白蛋白中，常温孵育1 h，再依次放在一抗、二抗溶液中结合反应，ECL显色，使用Image J软件分析条带灰度值，并计算目的蛋白相对表达。

2.5 p65激活剂对枸杞多糖干预BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞的作用 细胞分为为枸杞多糖中剂量组(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖)和枸杞多糖中剂量+PMA组(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖+2 ng/mL p65激活剂PMA)，加药培养24 h后收集细胞，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞侵袭，Western blot检测MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表达。

3 结果

3.1 枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡的影响 与对照组比较，模型组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与模型组比较，枸杞多糖各剂量组细胞凋亡率降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性，结果见图1、表1。由此可知，枸杞多糖抑制BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡。

图1 各组细胞凋亡

表1 枸杞多糖对细胞凋亡的影响

3.2 枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞侵袭的影响 与对照组比较，模型组细胞侵袭数减少(P<0.05)；与模型组比较，枸杞多糖各剂量组细胞侵袭数增加(P<0.05)，并呈剂量依赖性，结果见表2。由此可知，枸杞多糖促进BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞侵袭。

表2 枸杞多糖对细胞侵袭的影响

3.3 枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组细胞MMP-9、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，枸杞多糖各剂量组细胞MMP-9、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，Bax蛋白表达降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见图2、表3。

图2 各组细胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表达

表3 枸杞多糖对细胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

3.4 枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞p65蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组细胞p65蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，枸杞多糖各剂量组细胞p65蛋白表达降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见图3、表4。

图3 各组细胞p65蛋白表达

表4 枸杞多糖对细胞p65蛋白表达的影响

3.5 PMA逆转枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞p65蛋白表达的影响 各剂量枸杞多糖对人绒毛膜滋养层细胞均有作用，选择中剂量初步探讨其作用机制。与枸杞多糖中剂量组比较，枸杞多糖中剂量+PMA组细胞p65蛋白表达升高(P<0.05)，结果见图4、表5。由此可知，PMA逆转枸杞多糖对人绒毛膜滋养层细胞p65蛋白表达影响。

图4 PMA对细胞p65蛋白表达的影响

表5 PMA逆转枸杞多糖对细胞p65蛋白表达的影响

3.6 PMA逆转枸杞多糖对BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡率、侵袭数以及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 与枸杞多糖中剂量组比较，枸杞多糖中剂量+PMA组细胞凋亡率、细胞侵袭数及细胞中Bax、MMP-9蛋白表达均降低(P<0.05)，Bax蛋白表达升高(P<0.05)，见图5、表6。

图5 各组细胞凋亡(A)和MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表达(B)

表6 PMA对细胞凋亡率、侵袭数及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

4 讨论

环境污染是影响人类生殖系统正常功能的重要原因，其可诱发子宫内膜异位症、月经紊乱、多囊卵巢综合征等疾病[6]。绒毛滋养层细胞成功侵入子宫内膜是成功妊娠的基础[7]。BaP是一个典型的多环芳烃类化合物，可诱导DNA损伤、畸形和突变[8]。BaP处理可以诱导人绒毛膜滋养层细胞过度凋亡和侵袭能力下降，所以常作为体外研究绒毛滋养层细胞损伤的诱导因子[9]。Bax和Bcl-2均属于Bcl-2蛋白家族成员，分别在细胞凋亡过程中发挥促进和抑制作用[10]。MMP-9是细胞侵袭促进因子，其水平的高低与细胞侵袭能力正相关[11]。本实验结果表明，BaP处理后的人绒毛膜滋养层细胞凋亡率升高，细胞侵袭能力下降，细胞中Bax蛋白表达升高，Bcl-2、MMP-9蛋白表达下降，说明BaP抑制人绒毛膜滋养层细胞侵袭并诱导细胞凋亡，提示成功构建了人绒毛膜滋养层细胞体外损伤模型。

枸杞是我国传统中药，具有明目、补肝肾等功效。枸杞多糖是枸杞的关键活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、调节免疫力、降血脂、抗辐射等作用[12-14]。研究显示，枸杞多糖具有保护生殖系统的作用，可以降低生殖系统损伤，枸杞多糖灌胃后，实验性高血压妊娠小鼠胎盘明显改善[15-17]。本实验发现，枸杞多糖能够降低BaP处理后的人绒毛膜滋养层细胞凋亡，促进人绒毛膜滋养层细胞侵袭，降低细胞中促凋亡蛋白Bax的表达，增加细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促细胞转移蛋白MMP-9的表达，提示枸杞多糖可以抑制BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡并促进细胞侵袭。

p65是NF-κB信号激活的必需调控因子，其表达升高标志着NF-κB信号激活水平升高[18-21]。研究显示，NF-κB参与人绒毛膜滋养层细胞损伤，在细胞损伤发生时过度激活，而下调其激活水平可以促进人绒毛膜滋养层细胞侵袭并降低细胞凋亡发生[22]。本实验表明，枸杞多糖可以降低BaP处理后的人绒毛膜滋养层细胞中p65蛋白表达，而p65激活剂可以逆转枸杞多糖对人绒毛膜滋养层细胞凋亡和侵袭的作用。

综上所述，枸杞多糖可能通过降低BaP诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡、促进细胞侵袭而发挥保护作用，其机制可能与p65有关。目前对于枸杞多糖调控p65下游机制和体内作用还不清楚，仍需进一步探讨。