流动注射化学发光法测定阿卡波糖

赵冕，王贝贝，王冰，李献锐

(1.河北医科大学 教学实验中心，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学 药学院，河北 石家庄 050017)

近年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病已成为困扰中国居民的常见疾病[1].目前，临床上针对糖尿病患者多应用格列齐特、二甲双胍及阿卡波糖等药物进行治疗，其中阿卡波糖作为中国糖尿病市场占据份额最大的口服型降糖药，是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶活性，降低多糖及蔗糖分解为单糖的速度，从而减小和延缓小肠对葡萄糖的吸收，改善糖尿病人血糖异常，使血糖维持在一定水平，并减少并发症的发生[2].因此，建立一种快速、简便、准确测定阿卡波糖的新型分析技术，对保障患者的身体健康，有一定现实意义和长远的社会意义.有关阿卡波糖的分析方法，国内外报道的文献有高效液相色谱法[3-4]、电致发光分析法[5-6]、量子点荧光猝灭法[7-11]、分光光度法[12-15]等.但大多数方法都是利用α-葡萄糖苷酶催化α-葡萄糖苷键的解离，然后测量水解产物的浓度，实验过程复杂，耗时较长.

流动注射-化学发光(FI-CL)分析法具有仪器设备简单、操作方便快速、灵敏度高、线性范围宽等优点，适合在线快速检测，在医药生物、免疫检测和环境分析等领域被广泛应用[16].本实验研究了阿卡波糖对H2O2-鲁米诺体系发光强度的影响.结果表明，阿卡波糖可以使发光信号增强，结合流动注射技术，建立了一种简单、灵敏的测定阿卡波糖的新方法，并应用于不同品牌片剂中阿卡波糖的测定分析.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

IFFS-A型多功能化学发光检测器、IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司);KQ-100D型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；电子分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司)；pHS-3CU型酸度计(上海越平仪器有限公司)；微型高速离心机(Sigma公司).

1.2 试剂

阿卡波糖、鲁米诺(阿拉丁试剂上海有限公司)；质量分数30%H2O2(天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钾(天津市科密欧化学试剂有限公司)；盐酸(石家庄市试剂厂)；氢氧化钠(天津市化学试剂三厂)；乙二胺四乙酸二钠(天津博迪化工股份有限公司).卡博平牌阿卡波糖片剂(杭州中美华东制药有限公司)，规格50 mg×30片，国药准字H20020202；拜唐苹牌阿卡波糖片剂(拜耳医药保健有限公司)，规格50 mg×30片，国药准字H19990205，均购自石家庄市石药大药房.所用试剂均为分析纯，所用水为18MΩ·cm超纯水.

1.3 溶液配制

鲁米诺储备液(0.01 mol/L)：称取鲁米诺0.177 2 g，用0.10 mol/L的NaOH溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，避光放置1周后使用.使用时用pH 12.5的NaOH稀释.

阿卡波糖标准液(0.20 mg/mL)：称取阿卡波糖50.0 mg，用0.1 mol/L pH 6.70的磷酸盐缓冲液溶解并定容于250 mL容量瓶中，使用时用pH 6.70的PBS逐级稀释.

0.1 mol/L EDTA溶液：称取EDTA 3.722 4 g,用水溶解并定容于100 mL容量瓶中.

H2O2溶液(0.01 mol/L)：使用时用水稀释.

2 实验方法

2.1 实验流程

流动注射化学发光流程如图1所示.鲁米诺碱性溶液与过氧化氢溶液经过三通管混合后载入流路，待基线稳定后，通过进样阀将阿卡波糖溶液注入到鲁米诺与过氧化氢的混合溶液中，发生化学发光反应.记录化学发光信号，以峰高定量.

图1 流动注射化学发光分析流程示意Fig.1 Schematic diagram of FI-CL system

2.2 样品处理

阿卡波糖是一种C7N-氨基环醇类的假性四糖物质，含有多个羟基，极易溶于水.因此，水是阿卡波糖良好的溶出介质，将30片样品于玛瑙研钵中研成粉末后，置于称量瓶，于干燥器中保存、备用.称取阿卡波糖样品0.140 0 g置于离心管中，加5 mL 水在250 W 超声波清洗器中超声 5 min后，离心机中中速离心 5 min.取上清液移至25 mL 容量瓶中，依次再加5 mL 水进行超声、离心2次，合并上清液，用0.1 mol/L pH6.70的PBS溶液定容.准确移取2.50 mL于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L pH6.70的PBS溶液定容，摇匀，得样品测定溶液.在选定的实验条件下进行测定，根据回归方程求得阿卡波糖的质量浓度，按式(1)计算样品的质量分数.

(1)

式中，w为样品中阿卡波糖的质量分数(mg/g)；ρx为由标准曲线求得的样品测定液中阿卡波糖的质量浓度(mg/mL)；m为称取样品的质量(g).

3 结果与讨论

3.1 化学发光反应的动力学曲线

考察鲁米诺-H2O2-阿卡波糖系统的动力学性质.由图2可发现H2O2氧化鲁米诺的反应为快发光反应(2～3 s).加入0.020 mg/mL阿卡波糖时，发光强度由2 075增加到8 112.表明阿卡波糖对鲁米诺-H2O2发光体系具有明显的增敏作用.

a.H2O-2.0×10-5 mol/L 鲁米诺-5.0×10-3 mol/L H2O2；b.0.020 mg/mL 阿卡波糖-2.0×10-5 mol/L 鲁米诺-5.0×10-3 mol/L H2O2.图2 化学发光的动力学曲线Fig.2 Kinetic curve of chemiluminescence

3.2 仪器工作参数的选择

在其他实验条件不变的情况下，分别考察了光电倍增管的负高压、进样管长度和试剂流速对发光信号的影响.实验结果显示，当光电倍增管负高压700 V，进样管长度为10 cm，选择泵速40 r/min时有最佳的信噪比.

3.3 化学发光条件的选择

3.3.1 鲁米诺pH值的选择

发光强度的大小和稳定性会受pH值的影响.测试不同酸度条件下的发光信号，发现随溶液pH增大发光强度增大；但碱性太大时，基线升高，信号不稳定(图3).对数据进行统计，发现鲁米诺溶液pH值从10.0至12.5，相对发光强度明显增强，但12.5以后发光信号急速减弱 (图3) .因此选择鲁米诺溶液pH值为12.5.

内插图为不同pH鲁米诺-H2O2体系的发光曲线，pH自下而上依次增大.图3 鲁米诺溶液的pH对相对发光信号的影响Fig.3 Effect of the pH of lumiol on ΔI

3.3.2 鲁米诺浓度的选择

发光强度的大小依赖于发光试剂的浓度，考察了1.0×10-4～0.1 mmol/L内的鲁米诺对光强的影响.结果如图4所示，鲁米诺浓度从1.0×10-4增大至2.0×10-2mmol/L，相对发光强度明显增强，但2.0×10-2mmol/L以后发光信号增大不太明显.因此选择2.0×10-2mmol/L鲁米诺用于实验测试.

内插图为鲁米诺体系发光曲线，鲁米诺的浓度自下而上依次增大.图4 鲁米诺浓度和发光信号的关系Fig.4 Effect of luminol concentration on ΔI

3.3.3 H2O2浓度的选择

H2O2的浓度会影响发光信号.考察了H2O2浓度1.0×10-2～0.1 mmol/L对光强的影响.实验发现(图5)，H2O2浓度从1.0×10-2mmol/L增大至2.0 mmol/L，相对发光强度明显增强，但2.0 mol/L以后发光信号几乎不再变化.因此选择过氧化氢的最佳测试浓度为2.0 mmol/L.

内插图为鲁米诺体系发光曲线，H2O2浓度自下而上依次增大.图5 H2O2浓度对发光信号的影响Fig.5 Effect of H2O2 concentration on ΔI

3.4 线性范围、灵敏度和检出限

在选定的实验条件下，阿卡波糖在3.0×10-4～2.0×10-2mg/mL内，体系的发光信号与阿卡波糖的质量浓度呈良好的线性关系(图6)，回归方程为：ΔI=343.5ρ-0.146，r=0.998 7，检出限为2.3×10-4mg/mL.在最优条件下对0.010 mg/mL的阿卡波糖连续测定11次,相对标准偏差RSD为2.7%.

内插图为标准曲线;ρ(阿卡波糖)/(mg·mL-1)：a.3.0×10-4;b.1.0×10-3;c.5.0×10-3; d.1.0×10-2;e.1.2×10-2;f.1.5×10-2;g.1.8×10-2; h.2.0×10-2;i.2.5×10-2;j.3.0×10-2;k.5.0×10-2.图6 不同质量浓度阿卡波糖溶液的发光强度Fig.6 CL intensity in different concentrations

3.5 干扰实验

图7 共存离子的干扰Fig.7 Tolerable concentration rations of interfering species

3.6 样品测量

将所购买样品按“1.3”方法处理，在选定的实验条件下对样品进行6次平行测定，并做加标回收实验，结果见表1.

表1 阿卡波糖片剂中阿卡波糖的含量测定及回收率(n=6)Tab.1 Determination results of acarbose in sample and recovery experiments(n=6)

4 结论

基于在碱性条件下，阿卡波糖对鲁米诺-H2O2体系发光反应具有明显的增敏作用，建立了流动注射化学发光测定阿卡波糖的分析方法，并应用于阿卡波糖片剂中阿卡波糖的测定，为阿卡波糖的快速分析提供了新的测定方法，取得了令人满意的结果.