新型冠状病毒水貂变异株重组水泡性口炎病毒载体假病毒的拯救及鉴定

王 申，王玮琦,2，闫飞虎*，冯 娜，赵永坤，王铁成，高玉伟，杨松涛*，夏咸柱,2

(1.中国农业科学院 长春兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122；2.吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的大流行对世界人民生命健康安全及全球经济造成了巨大的冲击。截止到2021年10月23日，COVID-19已造成超过2.42亿人感染，超过492万死亡病例[1]。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)变异株的频繁出现是造成此次疫情绵延不断的重要原因。目前多个SARS-CoV-2变异株相继被报道出来，包括英国变异株α(B.1.1.7)[2]，南非变异株β(B.1.351)[3]，巴西变异株γ(P.1)[4]，印度变异株△(B.1.617.2)[5]等。其中与水貂密切相关的水貂变异株(cluster 5)备受关注，伴随着SARS-CoV-2水貂变异株由水貂向人类传播的病例被证实，荷兰、丹麦等国家数百万只水貂被扑杀[6-9]。目前国内外对于动物感染SARS-CoV-2的关注程度日益密切，相应的疫苗研究及接种计划也正在有序的推进。在这种形势下，构建SARS-CoV-2水貂变异株假病毒对于针对SARS-CoV-2水貂变异株的血清学研究、水貂用疫苗评估具有重要意义。

水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)属于弹状病毒科，水疱病毒属，是一种不分节段的负链RNA病毒[10]。VSV基因组较为简单，编码5种主要的蛋白，从3′端到5′端分别为：核蛋白(N)，磷蛋白(P)，囊膜糖蛋白(G)，多功能基质蛋白(M)和大聚合酶蛋白(L)[11]。VSV具有宿主噬性广、复制能力强、生长滴度高、安全性好、最大可容纳4.5 kb的外源基因、不易整合到宿主基因组中等优点[12-13]。在早期VSV反向遗传系统建立之后[14-15]，历经多次改造及优化，VSV作为假病毒载体[16-17]，病毒疫苗载体[18-20]，溶瘤病毒载体[21]得到了广泛的应用。先前的研究已经验证了SARS-CoV-2重组VSV载体假病毒表现出与真实SARS-CoV-2相似的针对中和抗体及可溶性人血管紧张素转换酶2蛋白的反应特性[16]，因此开发基于VSV载体的SARS-CoV-2假病毒可作为一种真实反映SARS-CoV-2病毒中和、病毒入侵抑制的有效替代模型。

本研究旨在构建并拯救SARS-CoV-2水貂变异株重组VSV载体假病毒并结合生长动力学曲线检测、RT-PCR鉴定、Western blot鉴定、透射电镜观察等技术对拯救的假病毒进行鉴定。这一假病毒为SARS-CoV-2水貂变异株的中和抗体评价和抗病毒药物筛选奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂BSR(BSR-T7)、Vero E6细胞由本实验室保存、以含10%胎牛血清的DMEM培养。DMEM、胎牛血清购自Gibco；PCR酶、AnzaT4连接酶购自TaKaRa；DNA Marker购自全式金；蛋白Marker、各种限制性核酸内切酶购自Thermo；RT-PCR试剂盒、磷酸钙转染试剂购自Invitrogen；兔抗SARS-CoV-2 S多克隆抗体购自义翘神州；山羊抗兔HRP抗体购自Bioworld；RNA提取试剂盒购自QIAGEN。

1.2 感染性克隆全长及辅助质粒的构建及鉴定

1.2.1VSV骨架cDNA克隆的构建及鉴定 基于VSV印第安纳株正链全长序列(GenBank ID:NC_001560.1)，在其5′起始端添加T7启动子序列5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；锤头状核酶序列：5′-TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCT-ATAGTC-3′；在N基因下游转录终止序列(GS)后添加2个酶切位点BsiWⅠ、PacⅠ：5′-CGTACGTTAATTAA-3′及转录起始序列(GE)：5′-AACAGATATC-3′，eGFP序列(GenBank ID:HV192862.1)；在P基因上游非编码区添加GS：5′-TATGAAAAAAA-3′、2个酶切位点BstEⅡ、BsiWⅠ：5′-GGTAACCGTACG-3′；在G基因的上游非编码区添加AscⅠ、SanDⅠ2个酶切位点：5′-GGCGCGCCAGATGGAGGGACCC-3′；下游非编码区添加PvuⅠ、Bsu36Ⅰ2个酶切位点：5′-GCGATCGCAGATGGACCTGAGG-3′；在全基因序列的3′末端添加丁型肝炎核酶序列：5′-GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGG-TCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCAC-GTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3′及T7终止子序列：5′-CTAGCATAACCCCTTGG-GGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTT-G-3′。

所构建的全长质粒交由上海生工生物工程有限公司以全基因合成的方式构建于pcDNA3.1(+)载体上，多克隆酶切位点选择为：NotⅠ、XhoⅠ。VSV骨架cDNA克隆命名为P3.1-VSV-eGFP。

1.2.2SARS-CoV-2重组VSV载体假病毒全长质粒的构建及鉴定 SARS-CoV-2 水貂变异株cluster 5 S基因(GISAID ID：EPI_ISL_616695)由上海生工生物工程有限公司合成。将酶切位点AscⅠ、PvuⅠ分别设计于S基因的上、下游引物中，使用下列引物对合成的SARS-CoV-2 S基因进行PCR扩增。

引物F：5′-ATGGCGCGCCATGTTTGTTT-TTCTTGTTTTA-3′;R：5′-CGATCGTTATGTGTAATGTAATTT-3′。

将VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP及SARS-CoV-2 S基因的PCR产物同时使用AscⅠ、PvuⅠ进行双酶切，胶回收P3.1-VSV-eGFP及SARS-CoV-2 S酶切产物，室温连接过夜，连接产物命名为P3.1-VSV△G-S-eGFP，对P3.1-VSV△G-S-eGFP进行AscⅠ、PvuⅠ双酶切鉴定。

1.2.3辅助质粒构建及鉴定 通过NheⅠ和NotⅠ酶切位点分别将VSV N、P、L及G基因的开放式阅读框(open reading frame,ORF)序列构建于pcDNA3.1(+)载体上,分别命名为P3.1-VSV-N；P3.1-VSV-P；P3.1-VSV-L和P3.1-VSV-G。对构建的辅助质粒进行NheⅠ、NotⅠ双酶切鉴定。

1.3 重组病毒的拯救及传代培养BSR细胞具有表达T7 RNA聚合酶的能力，同时具有较高的转染效率，因此被用于VSV病毒的拯救。BSR细胞使用含10%胎牛血清的DMEM进行培养，细胞传代至35 mm 6孔板培养过夜，生长密度为90%时用于转染。采用Invitrogen磷酸钙转染试剂，具体步骤参见说明书。6孔板中每孔质粒转染量为：P3.1-VSV-eGFP/P3.1-VSV△G-S 2.5 μg，P3.1-VSV-N 1.5 μg，P3.1-VSV-P 2.5 μg，P3.1-VSV-L 0.5 μg，P3.1-VSV-G 4.0 μg。2个重组病毒各拯救6个孔。转染后的细胞用含5%胎牛血清的DMEM进行培养，置于37℃、5% CO2培养箱16 h，再以含10% DMSO的PBS休克2.5 min，然后加入新鲜的含5%胎牛血清的DMEM，培养至72 h，进行传代。传代时，收集细胞及上清，-80℃冻融后，3 000 r/min离心5 min，去除细胞碎片，于Vero E6细胞上传代，37℃感作2 h，随后加入含5%胎牛血清的DMEM，继续培养48 h，细胞病变大于90%时收集细胞及上清，分装保存于-80℃，用于对救获病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP进行生长动力学检测。

1.4 重组病毒的生长动力学检测用含10% FBS的DMEM培养Vero E6细胞，当Vero E6细胞在6孔板内生长密度为80%～90%时，弃去培养基后用第5代(P5)母本病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP以MOI约为0.01的剂量分别感染Vero E6细胞，感染l h后用含10% FBS的DMEM继续培养细胞。分别于感染后0，12，24，36，48，60，72，84和96 h收集细胞上清液200 μL。将样品进行连续10倍稀释并且设置12个稀释度(10-12～10-1)，然后分别接种预先铺好的90%密度的Vero E6细胞的96孔板内，每个稀释度接种8个孔。接种72 h后观察细胞病变并统计每个稀释度的Vero E6细胞感染孔数，进行样品的半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose,TCID50)测定。

1.5 重组病毒的RT-PCR鉴定利用QIAGEN RNA提取试剂盒提取P5代重组病毒VSV△G-S-eGFP的基因组RNA，提取方法参照说明书。对所提取的RNA进行RT-PCR扩增。引物同SARS-CoV-2 S基因的PCR引物。对扩增得到的产物进行电泳及测序鉴定。设置母本病毒VSV-eGFP作为阴性对照组。

1.6 重组病毒的Western blot鉴定用含10%FBS的DMEM培养Vero E6细胞，当Vero E6细胞在6孔板内生长密度为90%时，弃去培养基后用P5代VSV△G-S-eGFP以MOI约为0.01的剂量分别感染Vero E6细胞，在37℃的条件下感染1 h后用含10% FBS的DMEM继续培养细胞。感染24 h后分别收集细胞，用NP-40裂解液在4℃的条件下裂解细胞l h，然后进行SDS-PAGE电泳并将目的蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂乳室温封闭30 min。以兔抗SARS-CoV-2 S(1∶2 500)为一抗室温孵育2 h后用PBST洗3次，再以山羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)为二抗室温孵育1 h后用PBST洗3次，最后利用化学发光成像系统Tanon-5200Multi进行成像。设置母本病毒VSV-eGFP作为阴性对照组。

1.7 重组病毒的透射电镜观察收获VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP F5代病毒感染细胞上清液，12 000 r/min 离心30 min，取100 μL上清采用磷钨酸负染法制备样本，透射电镜观察病毒粒子形态。

2 结果

2.1 感染性克隆全长及辅助质粒的构建及鉴定

2.1.1VSV骨架cDNA克隆的构建及鉴定 在VSV印第安纳株正链全长序列的基础上添加了一系列反向遗传元件：在5′起始端添加锤头状核酶、T7启动子序列；在N基因与P基因之间添加eGFP标签序列，eGFP上游添加BsiwⅠ和PacⅠ2个酶切位点及GE序列，eGFP下游添加BstEⅡ和BsiwⅠ2个酶切位点及GS序列；在G基因的上、下游分别添加AscⅠ、SanDⅠ及PvuⅠ、Bsu36Ⅰ2对酶切位点；在3′末端添加丁型肝炎核酶、T7终止子序列。将上述改造后VSV正链全基因序列合成于pcDNA3.1(+)载体上，多克隆位点为NotⅠ和XhoⅠ，pcDNA3.1(+)载体上的CMV启动子对接VSV正链基因组的5′端(图1A)。P3.1-VSV-eGFP经双酶切得到5 428和12 198 bp 2条目的条带，大小与预期相符，即VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP构建正确(图1C)。

2.2.2SARS-CoV-2重组VSV载体假病毒全长质粒的构建及鉴定 以SARS-CoV-2 S基因替换VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP中的G基因，得到SARS-CoV-2重组VSV载体假病毒全长质粒P3.1-VSV△G-S-eGFP(图1B)。经双酶切鉴定，得到2条目的条带分别为16 050和3 816 bp，与预期大小一致，即SARS-CoV-2重组VSV载体假病毒全长质粒构建正确(图1D)。

2.2.3辅助质粒的鉴定 辅助质粒经双酶切鉴定，得到的条带大小分别为5 428,1 269 bp(P3.1-VSV-N);5 428,798 bp(P3.1-VSV-P);5 428,1 576 bp(P3.1-VSV-L);5 428,6 330 bp(P3.1-VSV-G)。其中pcDNA3.1(+)载体的大小为5 428 bp,因此所得条带大小与预期一致，即辅助质粒P3.1-VSV-N、P3.1-VSV-P、P3.1-VSV-L、P3.1-VSV-G构建正确(图1C)。

A.VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP质粒图谱；B.重组cDNA克隆P3.1-VSV△G-S-eGFP质粒图谱；C.P3.1-VSV-eGFP及辅助质粒P3.1-VSV-N、P3.1-VSV-P、P3.1-VSV-G及P3.1-VSV-L酶切鉴定结果；D.P3.1-VSV△G-S-eGFP酶切鉴定结果；M1.Trans15K DNA Marker;1.P3.1-VSV-eGFP;2.P3.1-VSV-N;3.P3.1-VSV-P;4.P3.1-VSV-G;5.P3.1-VSV-L;M2.Trans5K DNA Marker;6.P3.1-VSV△G-S-eGFP

2.2 重组病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP的拯救将全长质粒P3.1-VSV-eGFP或P3.1-VSV△G-S-eGFP与辅助质粒P3.1-VSV-N，P3.1-VSV-P，P3.1-VSV-L及P3.1-VSV-G共转染BSR细胞48 h后，于倒置荧光显微镜下观察，转染后的BSR细胞出现明显的合胞体并伴随着绿色荧光(图2A,B)。传代至Vero E6细胞后，Vero E6细胞出现了明显的圆缩病变，并显示绿色荧光(图2D,E)。VSV△G-S-eGFP与母本病毒VSV-eGFP在BSR及Vero E6上引起的病变相似。结合传代过程中出现的绿色荧光及细胞病变，判断重组病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP拯救成功。VSV-eGFP在所有孔中(6/6)均拯救成功，而VSV△G-S-eGFP在大部分孔中(4/6)拯救成功，即重组病毒拯救效率较高。

A.BSR细胞拯救VSV-eGFP 48 h(荧光，100×，合胞体形成如箭头所示)；B.BSR细胞拯救VSV-eGFP 48 h(自然光，100×，合胞体形成如箭头所示)；C.BSR细胞拯救VSV△G-S-eGFP 48 h(荧光，100×，合胞体形成如箭头所示)；D.BSR细胞拯救VSV△G-S-eGFP 48 h(自然光，100×，合胞体形成如箭头所示)；E.正常BSR细胞(自然光，100×)；F.E6细胞接毒VSV-eGFP F2代24 h(荧光，50×，细胞圆缩如箭头所示)；I.E6细胞接毒VSV-eGFP F2代24 h(自然光，50×，细胞圆缩如箭头所示)；J.E6细胞接毒VSV△G-S-eGFP F2代24 h(荧光，50×，细胞圆缩如箭头所示)；K.E6细胞接毒VSV△G-S-eGFP F2代24 h(自然光，50×，细胞圆缩如箭头所示)；L.正常E6细胞(自然光，50×)

2.3 重组病毒的生长动力学曲线使用VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP感染Vero E6细胞后，根据不同时间节点收集病毒的TCID50绘制一步生长曲线。VSV-eGFP的最高生长滴度出现在36 h左右，生长滴度可达109.2TCID50/mL。由于重组了较大的外源基因，VSV△G-S-eGFP与母本病毒VSV-eGFP相比生长滴度有所降低，最高生长滴度出现在72 h左右，生长滴度可达106.8TCID50/mL(图3)。

图3 母本病毒VSV-eGFP及重组病毒VSV△G-S-eGFP的生长动力学曲线

2.4 重组病毒的RT-PCR鉴定结果使用SARS-CoV-2-S特异性引物进行RT-PCR鉴定时，VSV△G-S-eGFP组可在3 816 bp左右出现特异性条带，经测序所得序列与预期一致。而VSV-eGFP则不能出现特异性条带(图4)。上述结果表明重组病毒VSV△G-S-eGFP拯救成功。

2.5 重组病毒的Western blot鉴定结果VSV△G-S-eGFP组在180 kDa左右观察到特异性条带，而VSV-eGFP组未观察到特异性条带(图5)。结果表明SARS-CoV-2的S蛋白在重组病毒VSV△G-S-eGFP中有效表达。

M.Trans5K DNA Marker;1.VSV△G-S-eGFP;2.VSV-eGFP

M.Thermo 26619 protein Marker;1.VSV△G-S-eGFP;2.VSV-eGFP

2.6 重组病毒的透射电镜观察结果母本病毒VSV-eGFP及重组病毒VSV△G-S-eGFP在电镜下呈典型的子弹状形态，粒子表面有纤突。重组病毒的直径在200 nm左右，与文献报道一致(图6)。

图6 重组病毒VSV-eGFP(A)及VSV△G-S-eGFP(B)的透射电镜观察(40 000×)

3 讨论

自2019年COVID-19首次报道以来[22]，COVID-19疫苗及抗体药物的研究迅速铺展开来，截至2021年10月24日，已经有128款COVID-19疫苗获批进入人类临床试验阶段，194款疫苗处于临床前阶段[23]。伴随着多个SARS-CoV-2变异株的相继出现，SARS-CoV-2变异株对于现有疫苗、抗体及药物保护效力影响的研究是一项迫在眉睫的需要。然而，SARS-CoV-2的实验室研究需要在配备正压呼吸器的生物安全三级(biosafety level 3,BSL3)实验室条件下进行，而目前BSL3实验室数量有限，因此开发出能模拟SARS-CoV-2抗原表位的假病毒可作为一种替代模型，实现生物安全二级实验室(biosafety level 2,BSL2)条件下的SARS-CoV-2假病毒中和试验、病毒入侵抑制试验[16-17,24-25]。与HIV慢病毒系统包装的SARS-CoV-2假病毒相比，慢病毒系统包装的假病毒需要在使用前临时制备，且易受细胞状态等多方面因素的影响。而SARS-CoV-2重组VSV假病毒可大量储备，使用方便。目前尚无SARS-CoV-2水貂变异株重组VSV载体假病毒的相关报道，因此，本研究拯救的SARS-CoV-2水貂变异株重组VSV载体假病毒，填补了国内外空白，不仅可用于现有疫苗、抗体对SARS-CoV-2水貂变异株的中和能力评估，同时可用于针对水貂动物群体的疫苗评估。

VSV载体假病毒的拯救依赖于VSV反向遗传操作系统。pcDNA3.1(+)作为高效的哺乳动物表达载体，在狂犬病病毒的反向遗传中表现出了比PCI载体更高的病毒拯救效率[26]，因此本研究选择将VSV感染性克隆全长质粒及辅助质粒均构建于pcDNA3.1 (+)载体上，由此确保更高的转录效率及病毒拯救效率。经典的VSV拯救方法依赖于稳定表达T7 RNA聚合酶的牛痘病毒或T7辅助质粒来增强病毒拯救过程中T7 RNA聚合酶的表达，提高病毒拯救效率[14-15]。该方法在后续传代过程中需要通过反复过滤并加入阿拉伯糖苷等方式来抑制痘病毒的繁殖，且痘病毒与VSV之间的相互作用目前尚不明确，在重组较大的外源基因如SARS-CoV-2 S基因后病毒拯救及传代十分困难[16,18]。本研究中无需痘病毒或T7辅助质粒的掺入，将VSV感染性克隆构建于高效的pcDNA3.1(+)哺乳动物表达载体上，搭配使用稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞，实现了对VSV的高效拯救。

使用SARS-CoV-2的S基因替换VSV骨架cDNA克隆中的G基因后，本研究构建并拯救了VSV△G-S-eGFP这一携带绿色荧光标签的SARS-CoV-2水貂变异株重组VSV假病毒。通过对救获病毒的生长动力学曲线检测、RT-PCR鉴定、Western bolt鉴定、透射电镜观察等技术，证实SARS-CoV-2重组VSV载体假病毒VSV△G-S-eGFP拯救成功。VSV△G-S-eGFP这一假病毒对于SARS-CoV-2水貂变异株血清学研究、抗体筛选、病毒入侵抑制类药物筛选及疫苗诱导的中和抗体评估具有重要意义。