ICP22BP通过调控Wnt信号通路影响胶质母细胞瘤细胞增殖的研究

党 利 王长爽 王 帅

胶质母细胞瘤也称为多形性胶质母细胞瘤 (GBM)，是最致命和最常见的脑肿瘤形式之一，多发于40～60岁年龄段的人群[1,2]。大约 80% 的 GBM 肿瘤位于大脑半球，只有不到 5%的GBM肿瘤位于小脑、脑干和脊髓[3]。虽然目前临床上对于GBM的治疗研究已经有了大量的进展，但是其五年存活率依然令人沮丧。这其中一个重要原因是GBM的高复发性和较强的药物耐受[4,5]。造成GBM的高复发和药物耐受的主要原因是GBM通常以胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)的存在为特征[6]。而目前已经有很多研究表明GSCs与GBM的复发与耐药有关，此外由于其存在于血管周围而难以靶向造成肿瘤细胞的持续更新[6-8]。

GSCs细胞通过多种信号通路维持其干细胞状态[7,9]，这其中越发引起研究者注意的一条信号通路就是Wnt信号通路。目前已有研究报道Wnt信号通路的失调与神经元来源的体细胞恶性肿瘤相关[10]。Wnt信号通路作为细胞间交流、细胞命运决定和细胞迁移的重要调节因子。Wnt信号失调通常与其重要的组成原件突变有关，而Wnt信号的失调常常与癌症相关。异常的Wnt信号在多种癌症均有发现，通常表现为Wnt信号的异常激活从而造成其下游基因的大量转录。

本研究基于临床病例的表达量检测和TCGA数据库分析揭示出ICP22BP在GBM癌组织中的表达量显著高于在GBM癌旁组织中的表达量。此外我们还证明 ICP22BP通过影响Wnt信号通路从而促进GBM细胞系A172细胞增殖。这为后续GBM的治疗研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 GBM病例收集

本研究于2018年1月至2020年12月在河南大学附属医院采集了86例GBM患者的临床样本。该GBM患者队列的人口统计数据如表1所示。本试验获得河南大学伦理委员会批准，所有患者均获得书面知情同意。

表1 GBM患者样本特征

1.2 细胞培养和转染

将A172细胞维持在含有10%FBS(GETMHyclone，Utah,U.S)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(SH30010，GETMHyclone，Utah,U.S)的完全DMEM培养基中，并在细胞培养箱中培养(37℃和 5%CO2)。

A172细胞在转染前一天进行传代培养，以达到30%～50%的汇合度。使用终浓度为50 nM Lipofect-amine 2000转染试剂进行细胞转染，转染混合液孵育4 h后，使用完全培养基换液，48 h后检测基因表达情况和细胞增殖。

1.3 实时荧光定量PCR

采用Trizol(15596018,Life Technologies,USA)法提取全细胞RNA，然后使用BeyoRTTMⅢ cDNA合成试剂盒(Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)将RNA转录成cDNA。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(D7260,Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)试剂盒用于进行实时PCR检测。qPCR实验结果采用2-△△CT法计算。引物序列见表2。

表2 不同基因的引物序列

1.4 蛋白质印迹分析

应用BeyoLyticTM哺乳动物活性蛋白提取试剂(Beyotime Biotechnology，上海，中国)提取细胞和组织总蛋白。然后用30～40 μg细胞总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白转膜。然后将转移的NC膜与相应的一抗：anti-ICP22BP(ab247013，abcam，USA)和anti-GAPDH(ab8245，abcam，USA)(1∶500)在 4℃下孵育过夜。

1.5 细胞增殖试验

将消化后各组细胞铺96孔板，每孔1×104个细胞。各时间点(0 h、24 h、48 h、72 h)收集细胞，加入10 ml CCK8溶液单液细胞增殖检测液。孵育4 h后，使用酶标仪检测OD492的吸光度。

1.6 数据统计分析

所有统计数据均采用T检验，数据分析软件为GraphPad Prism 6，P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 ICP22BP基因在GBM肿瘤组织中高表达

通过对于GBM TGCA和GETX数据中ICP22BP的mRNA表达量分析，发现与正常脑部组织相比，GBM肿瘤组织中ICP22BPmRNA表达水平显著升高(图1A)。为了进一步确定，收集的86例GBM患者病例样本中对比癌旁组织中和GBM肿瘤组织中ICP22BP mRNA表达水平。qPCR结果显示，ICP22BP在GBM患者病例样本的癌旁组织和GBM肿瘤组织中表达趋势与数据库分析结果一致：GBM肿瘤组织中的ICP22BP mRNA表达水平要显著高于癌旁组织(图1B)。随机取3例GBM患者病例样本的癌旁组织和GBM肿瘤组织进行蛋白质印迹分析实验，分析ICP22BP蛋白表达水平趋势。蛋白质印迹分析实验结果显示：ICP22BP蛋白表达水平趋势与mRNA水平表达一致(图1C)。上述实验结果表明，ICP22BP基因在GBM肿瘤组织显著高表达。提示，ICP22BP基因可能是作为促癌基因在GBM中存在。

注：A为对于TCGA数据库中GBM肿瘤组织样本和GETX数据样本中ICP22BP的mRNA 表达水平；B为收取的86例GBM病例样本中癌旁组织和肿瘤组织中ICP22BP的mRNA 表达水平；C为收取的86例GBM病例样本中随机取3例的癌旁组织(P-1,P-2,P-3)和肿瘤组织(T-1,T-2,T-3)中ICP22BP的蛋白表达水平。图1 ICP22BP的mRNA表达水平

2.2 敲低ICP22BP表达显著抑制GBM细胞的细胞增殖

ICP22BP在GBM肿瘤组织中呈显著高表达，推测ICP22BP基因可能是作为促癌基因在GBM中存在。为了验证这个猜想，在GBM细胞系A172细胞中通过siRNA敲低ICP22BP的表达。如图2A&B所示，通过siRNA成功敲低了ICP22BP的表达。随后细胞增殖实验结果表明ICP22BP的表达减少会显著抑制A172细胞的细胞增殖(图2C)。这些实验数据表明，ICP22BP基因可以促进A172细胞的增殖。这与：“ICP22BP基因可能是作为促癌基因在GBM中存在”一致。

注：A&B为A172细胞中转染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP处理48 h后，ICP22BP的蛋白(A)和mRNA(B)表达水平；C为A172细胞中转染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP处理细胞增殖速率；D为A172细胞中转染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP处理48 h后,wnt信号通路下游相关基因mRNA表达水平。图2 ICP22BP表达对GBM细胞增殖的影响

2.3 ICP22BP基因与wnt信号通路在A172细胞中的相互作用

之前研究报道，wnt信号通路的失调在GBM发生发展过程中起到重要作用。具体表现特征是wnt信号通路在GBM肿瘤组织中异常激活。由于ICP22BP在GBM肿瘤组织中高表达，猜测ICP22BP可能与wnt信号通路在ICP22BP中出现互作。为了验证这个猜想，在A172细胞中敲低ICP22BP的表达，观察ICP22BP基因表达量下降对于wnt信号通路下游相关基因表达的影响。qPCR结果显示，在A172细胞中敲低ICP22BP的表达可以显著抑制wnt信号通路下游相关基因(cMYC，c-JUN,WISP1和PPARD)表达。这表明，ICP22BP基因与wnt信号通路在GBM细胞中存在相互作用。

3 讨论

胶质母细胞瘤 (GBM)，作为最致命和最常见的脑肿瘤形式之一，目前临床上有效的治疗手段还十分有限。究其原因，主要还是我们对于GBM发病机理和发生发展过程中相关分子机制了解十分有限。基于此我们通过对于TCGA和GETX数据中GBM相关基因表达信息进行分析，以期能够找到新的线索。我们发现ICP22BP这一基因在GBM肿瘤组织中的异常高表达，提示我们这一基因可能在GBM中行驶促癌基因功能。同时我们在对于GBM患者相关临床样本验证中也证明了，ICP22BP这一基因在GBM肿瘤组织中的异常高表达。同时在敲低ICP22BP基因时发现会显著抑制GBM细胞系A172细胞的细胞增殖。这些数据表明，ICP22BP这一基因可能在GBM中行驶促癌基因功能。

wnt信号通路分为经典wnt信号通路和非经典wnt信号通路，其中经典wnt信号通路转录的相关下游基因：cMYC，c-JUN,WISP1和PPARD等，常常与癌症发生发展相关[11-14]。这与我们的发现一致：下调ICP22BP基因的表达可以显著抑制经典wnt信号通路下游基因的转录。这也从侧面验证ICP22BP基因是通过调节经典wnt信号通路从而影响GBM细胞A172细胞的细胞增殖。这其中相关具体的调节机制，本研究中并没有研究。这也是我们后续的研究重点：找出ICP22BP基因调节经典wnt信号通路潜在分子机制。

综上所述，本研究证明了ICP22BP基因在GBM肿瘤组织中高表达。同时ICP22BP基因通过调节经典wnt信号通路从而影响GBM细胞A172细胞的细胞增殖。这为GBM的后续病理机制相关研究提供了一定的理论基础。