啮齿类肝炎病毒感染大鼠模型的建立

马鑫宇，官月婵，吴爽靖，谢明学，毕研伟，寸韡

1.昆明医科大学，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650000

啮齿类肝炎病毒（Rodent Hepacivirus，RHV）是一种通过血液传染大鼠的肝炎病毒［1］，与人类丙型肝炎病毒（hepaci C virus，HCV）具有同源性［2-3］。RHV属于单链RNA 病毒，基因组全长9 600 bp，包括5′UTR、1 个不间断的开放阅读框（open reading frame，ORF）和 3′UTR，ORF 至少编码 10 种蛋白质，包括结构蛋白（core、E1、E2）和非结构蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。RHV rn1 亚型（RHV-rn1）的 5′和3′端UTR 中包含多个蛋白裂解位点和二级结构，其中5′非编码区含有2 个miR-122 结合位点。

RHV-rn1 可造成慢性高滴度病毒血症，引起慢性感染及渐进性肝损伤，宿主具有干扰素通路持续激活症状，这些临床症状与人类HCV 感染较相似，同时，HCV 的抗病毒药物可抑制RHV 感染，表明RHV-rn1感染的大鼠模型具有作为研究人类HCV 替代模型的潜力［4-6］。因此，建立RHV-rn1 感染的大鼠模型有助于HCV 的相关研究，但目前尚无可行的细胞培养体系，无法通过细胞培养获得病毒颗粒［7-8］。前期研究发现，体外转录获得的病毒全长基因组RNA 经注射进入宿主体内可能诱发病毒感染，如大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）［9］、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）［10］、兔出血热病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）［11］和HCV［12］等。本研究采用反向遗传学方法获得RHV-rn1，直接注射至大鼠体内，建立RHV-rn1 感染的大鼠模型，以期为人类HCV 的相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒 质粒pcw1057［根据NCBI 登录的RHV-rn1 基因组（KX905133.1）合成病毒 cDNA 序列，全长9 656 bp，连接至含有T7 启动子的载体上］由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoRⅤ购自美国NEB公司；体外转录T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System 试剂盒购自美国Promega 公司；RNA纯化回收试剂盒RNeasy Mini Kit 购自德国Qiagen公司；Trizol 试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；DL10000 DNA marker 购自上海捷瑞生物工程有限公司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.3 实验动物 SPF 级 Wistar 大鼠，雌性，3 ～ 6月龄，体重约180 g，购自中国医学科学院医学生物学研究所，动物合格证号为：XDWSYB20210228。实验对大鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照本研究所动物伦理相关规定进行（文件号为：DWLL202007001）。

1.4 体外转录RNA 及纯化 将质粒pcw1057 经限制性内切酶EcoRⅤ酶切，用酚氯仿抽提线性化DNA，体外转录T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System 试剂盒进行体外转录，转录产物经RNeasy Mini Kit 试剂盒纯化，获得RHV-rn1 基因全长RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 动物分组及给药 分别经大鼠肝内直接注射和尾静脉注射途径给予纯化的RHV-rn1 基因全长RNA，5 μg ／（100 μL·只），每组 2 只；同时设对照组（PBS，100 μL ／ 只），1 只。

1.6 大鼠血清中RHV-rn1 基因组拷贝数的检测 采用RT-qPCR 法。用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂盒测定RHV-rn1 基因全长RNA 浓度，根据浓度计算基因组拷贝数，即为RT-qPCR法的标准品。以RHV-rn1 基因组序列5′-TACATGGCTAAGCAATACGG-3′为正链引物，5′-AAGCGCAGCACCAATTCC-3′为负链引物，5′-CTCACGTACATGACGTACGGCATG-3′为特异性 taqman FAM 探针，引物和探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成。注射后2 d 起每日经各组大鼠尾静脉采血，至7 d，随后每7 d 采血，肝内注射组和对照组采血至49 d，尾静脉注射组采血至28 d，分离血清，Trizol 试剂提取RNA，以其为模板进行RT-qPCR 扩增。RT-qPCR 扩增条件为：42 ℃5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，共 45 个循环；53 ℃45 s，60 ℃ 45 s。利用RT-qPCR 法标准品建立标准曲线，计算大鼠血清中RHV-rn1 基因组拷贝数。

1.7 子代RHV-rn1 感染能力的检测 将纯化的RHV-rn1 基因全长 RNA 经肝内注射大鼠，5 μg ／（100 μL·只），注射后 49 d 经尾静脉采血，分离血清（P0 代 RHV-rn1）；另取 4 只大鼠（编号 1 ～ 4），经尾静脉注射 P0 代 RHV-rn1，100 μL ／只，同时设 PBS 对照组，注射后 3、14、56、106、134 d 经尾静脉采血，分离血清，采用 RT-qPCR 法（同 1.6 项）检测 RHV-rn1 基因组拷贝数。

1.8 RHV-rn1 对大鼠器官亲嗜性的检测 将P0 代RHV-rn1 经尾静脉注射大鼠，100 μL ／ 只，注射后第7 天经腹主动脉采血，分离血清，即P1 代RHV-rn1，相同方法获得 P2 和 P3 代 RHV-rn1，RT-qPCR 法（同1.6 项）检测RHV-rn1 基因组拷贝数。取RHV-rn1在体内传至P3 代时的3 只大鼠，无菌取大鼠的肌肉、脑、甲状腺、肺、小肠、肾脏、性器官、心脏、脾脏、肝脏组织，剪成小块，研磨，制备为细胞悬液，用Trizol 提取 RNA，RT-qPCR 法（同 1.6 项）检测 RHV-rn1 基因组拷贝数。

1.9 RHV-rn1 感染能力的检测 分别用剂量为101、102、103、104、105copies ／ μL 的 P3 代 RHV-rn1 经尾静脉注射大鼠，100 μL ／ 只，于注射后 0、3、6、12 d，经尾静脉采血，分离血清，采用RT-qPCR 法（同1.6项）检测RHV-rn1 基因组拷贝数。

2 结 果

2.1 RHV-rn1 基因全长RNA 的鉴定 纯化的RHV-rn1 基因全长RNA 经1%琼脂糖凝胶电泳分析，于约10 000 bp 处可见目的基因条带，大小与预期相符，见图1。

图1 RHV-rn1 基因全长RNA 电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of full-length RNA of RHV-rn1 gene

2.2 大鼠血清中的RHV-rn1 基因组拷贝数 肝内注射组2 只大鼠于注射后2 d 出现高滴度病毒血症，血液中RHV-rn1 基因组拷贝数达 105copies ／ μL，注射后 3 d拷贝数大幅下降，注射后 4 d 上升，达 105copies／μL，随后呈缓慢上升趋势；至注射后14 d 开始稳定，维持约在 106copies ／ μL，可持续至注射后 49 d。尾静脉注射组2 只大鼠直至28 d 时未检测到病毒血症。见图2。

图2 RT-qPCR 法检测各组大鼠血清中RHV-rn1 基因组拷贝数Fig.2 Determination of RHV-rn1 genome copy number in sera of rats by RT-qPCR

2.3 子代 RHV-rn1 的感染能力 P0 代RHV-rn1注射3 d 后，大鼠血清中RHV-rn1 基因组拷贝数为105copies ／ μL；随后血清中的拷贝数逐渐上升，至14 d 时，维持约在 106copies ／ μL。见表 1。表明 P0代大鼠血液中含有感染性RHV-rn1 颗粒，且可形成慢性感染。

表1 感染子代 RHV-rn1 大鼠血清中的 RHV-rn1 基因组拷贝数（copies ／ μL）Tab.1 Genome copy numbers of RHV-rnl in sera of rats infected with offspring HRV（copies ／ μL）

2.4 RHV-rn1 对大鼠器官的亲嗜性 P1、P2、P3 代RHV-rn1 的拷贝数分别为 1.12 × 107、7.5 × 106、1.65 × 107copies ／ μL。RHV-rn1 在体内传至 P3 代时，大鼠的肌肉、脑、甲状腺、肺、小肠、肾脏、性器官、心脏、脾脏、肝脏组织中，肝脏中的RHV-rn1 基因组拷贝数达107copies ／ mg，高于其他组织器官1 000 倍以上，见图3。表明RHV-rn1 是一种嗜肝性病毒。

图3 大鼠不同器官／ 组织中RHV-rn1 基因组拷贝数Fig.3 Genome copy numbers of RHV-rnl in various organs ／tissues of rats

2.5 RHV-rn1 的感染能力 RHV-rn1 半数感染的基因组拷贝数为102.5copies，见图4，表明RHV-rn1具有较强的感染能力。

图4 RHV-rn1 半数感染剂量试验Fig.4 Test for median infectious dose of RHV-rn1 of P3

3 讨 论

本研究采用经反向遗传学方法合成RHV-rn1基因组cDNA，体外转录获得的病毒基因组RNA［13-14］，通过肝脏注射至大鼠体内，在体内扩增病毒，建立该动物模型，于不同时间点采血，分离血清，RT-qPCR 法检测RHV-rn1 基因组拷贝数。检测结果显示，接种RHV-rn1 后，大鼠可形成高滴度病毒血症，且可形成慢性感染，表明RHV-rn1 基因组含有完整的5′和3′UTR 结构，具有使大鼠形成病毒血症的能力。

人类乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和 HCV均是慢性肝炎病毒，有研究表明，通过尾静脉直接注射HBV 基因组可在小鼠体内形成高滴度病毒血症［14］，HCV 则通过肝内直接注射病毒基因组感染黑猩猩形成病毒血症［15］。RHV-rn1 也为慢性肝炎病毒，因此本实验采用尾静脉和肝内注射两种方式给予RHV-rn1 RNA，RT-qPCR 检测结果显示，肝内注射组大鼠血清中的RHV-rn1 基因组拷贝数远高于尾静脉注射组及对照组，尾静脉注射组与对照组差异较小，表明RHV-rn1 基因组RNA 经肝内注射具有较强的感染能力，可能是由于肝脏细胞具有较强的吸收外来物质的能力，病毒RNA 更易进入肝细胞，有利于病毒基因组复制。

模拟RHV 血液传播的过程，本实验用P0 代大鼠血清成功感染健康大鼠，表明子代RHV 具有较强的感染能力，可形成慢性感染，且对肝脏有较强的亲嗜性。通过个体传代，获得了P1、P2、P3 代病毒，拷贝数分别为 1.12 × 107、7.5 × 106、1.65 × 107copies ／ μL。RHV-rn1 感染能力试验计算得出，RHV-rn1病毒半数感染的基因组拷贝数为102.5copies，表明RHV-rn1具有极强的感染能力，仅需感染大鼠的1 μL 血液就能感染其他健康大鼠，是一种传染性较强的病毒。本研究建立了RHV-rn1 感染的大鼠模型，为慢性肝炎致病机理和免疫反应的相关研究奠定了基础。