基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶水解酶对肝纤维化的调控及相关治疗药物研究进展

黄 倩， 杨 燕， 曾 锐， 姚孟林， 孙 琴,2

1 西南医科大学 a.药学院， b.中西医结合学院， 四川 泸州 646000;2 西南医科大学附属中医医院 中西医结合药物研究中心， 四川 泸州 646000

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程。病毒感染、免疫或自身免疫疾病、饮酒、遗传及药物等均可能成为肝纤维化的诱发因素[1]。在这些因素作用下，正常肝细胞变性、坏死，产生炎症反应，最终刺激纤维组织增生而形成肝纤维化。

肝脏内弥漫性细胞外基质(ECM)的沉积是肝纤维化的主要病理特征，其表现为Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达远高于正常水平[2]。ECM生成与水解的平衡是由基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)与基质金属蛋白酶水解酶(tissue inhibitors of metallopro-teinases, TIMP)调控的，当TIMP与MMP的表达失衡时，ECM的沉积可能加重，进而可能加快或加重肝纤维化[3]。现阶段肝纤维化的治疗十分困难，目前尚无基于病理生理学治疗肝纤维化的药物，仅有扶正化瘀胶囊、复方鳖甲软肝片、安络化纤丸、强肝胶囊/丸、安珐特及肝爽颗粒等几个中成药被批准基于适应证用于肝纤维化治疗[4]。新药的研发有赖于潜在治疗靶点和潜在活性成分的发掘，故本文基于中国知网、万方医学网、中国生物医学文献数据库、维普数据库、PubMed及Web of science等数据库，总结了近5年来基于MMP/TIMP的肝纤维化实验研究及相关报道，分析通过MMP/TIMP发挥抗肝维化活性的组分及其作用机制，以期阐明MMP/TIMP与肝纤维化的关系，为肝纤维化治疗靶点的发现及抗肝纤维化药物的开发提供新的线索和理论支撑。

1 MMP与TIMP的结构、分类及功能

1.1 MMP的结构、分类及功能 MMP由锌依赖性蛋白水解酶组成，可以降解ECM的组成成分，如层粘连蛋白、胶原、纤连蛋白等组分。MMP有3个共同的结构区域，分别是具有“半胱氨酸开关”的前肽结构域、具有HEXGHXXGXXHS序列的催化锌结合的结构域和类血红素蛋白结构域[5]。

目前为止，已经发现28种不同类型的MMP，其中至少有23种在人体组织中表达，其中结构研究较为明确的共有22种，可被分为7类(图1)[6]；作用底物研究较为明确的共有21种，可被大致分类6类(表1)。

注：信号肽、前肽及具有活化锌的催化结构是MMP的共性结构。

表1 MMP主要功能分类表

MMP具有降解细胞外基质蛋白、糖蛋白、膜受体及细胞因子等生物功能，可参与组织修复和再生、胚胎形成和发育、血管生成及伤口愈合等多种生物过程。MMP的表达或活性异常时，常常伴随着不同疾病的发生，肝纤维化的发生与发展主要与MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-9等几种酶的活性有关[7]。

1.2 TIMP的结构、分类及功能 TIMP是MMP家族的抑制剂，由184～194个氨基酸组成，分子量为25～31 kD[8]。现代研究已发现的TIMP包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4四类。TIMP-3的表达较为广泛，TIMP-1、TIMP-2主要在肝脏组织中表达，TIMP-4则只在脑、心脏、卵巢和骨骼肌等组织中少量表达。4种不同亚型的TIMP均能在一定程度上抑制MMP的活性，但其在结构上却存在一定的差异，如TIMP-2与TIMP-4在结构上具有一定的相似性，而TIMP-1的结构较为独特。TIMP-1主要抑制胶原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)的活性，同时TIMP-1可能对细胞的生长有一定的调节作用;TIMP-2过量时会抑制明胶酶原A的激活，但适量 TIMP-2对于明胶酶原A的激活似乎是必不可少的; TIMP-3能诱导肿瘤细胞和血管平滑肌细胞凋亡，TIMP-4的功能目前尚未明确[8]。

2 MMP/TIMP对肝纤维化的调控

2.1 MMP在肝纤维化中的作用 目前肝内发现的MMP共有8种，分别是MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12及MMP-13[9]，它们可直接或间接调控ECM的降解，在肝纤维化的形成与消退过程中有重要作用。MMP-1为间质胶原酶，主要对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原有较强的水解作用。有研究[10]表明，适当上调MMP-1的表达在一定程度上可以减缓肝纤维化的进程。MMP-2是一种明胶酶，由活化的肝星状细胞(HSC)产生。而MMP-2的激活，是由MMP-14介导，其通过与Pro-MMP-2和TIMP-2在HSC细胞膜上形成三元聚合而发生。较多研究[11]认为，MMP-2在纤维化阶段表达量升高，而在肝硬化与肝纤维化逆转过程中逐渐降低。MMP-3在HSC活化的早期短暂表达，其可以通过剪切短肽的形式激活多种金属蛋白酶，包括MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9和MMP-13等，对肝纤维的发生与发展有间接调控作用。而在急性和慢性肝损伤动物模型中，MMP-9的表达结果不一致。在单次注射CCl4引起的急性肝损伤中，注射后3 d内活性MMP-9增加，而24 h后MMP-9基因表达无变化。在8周CCl4注射方案诱导的慢性肝损伤中，既没有观察到MMP-9 mRNA表达的变化，也没有观察到活化的MMP-9的出现。而在胆管结扎诱导的肝纤维化大鼠模型中，检测到Pro-MMP-9的上调，这表明MMP-9对肝纤维化的影响与炎症之间存在一定程度上的关联[12]。

2.2 TIMP在肝纤维化中的作用 迄今为止，已知有4种TIMP对肝纤维化的形成有不同程度的影响。TIMP-1与TIMP-2和肝纤维化的相关性初次发现是在炎症刺激下的大鼠肝细胞中；随后，在CCl4、胆管结扎诱导的大鼠肝纤维化模型中发现TIMP-1和TIMP-2的表达增强，再次证实两者与肝纤维的相关性[13]。慢性肝损伤动物模型强调TIMP-1对肝纤维发展的重要性[14]，过量表达TIMP-1的转基因小鼠与野生型小鼠相比，经CCl4处理后表现出更加严重的肝纤维化症状。另一方面，TIMP-1由TGFβ调控，其本身并不能诱导纤维化的发生。TIMP-1主要通过与MMP结合抑制胶原酶的活性，以免新合成的胶原被MMP立即降解，同时TIMP-1也能够阻止活化的HSC中前体基质金属蛋白酶的激活[12]。显然，TIMP-1在肝纤维化的调控中起着重要作用。TIMP-2与TIMP-1的表达情况类似，在原代培养的HSC中不表达，当HSC被活化后表达增强[14]。研究[15]发现在肝纤维化形成过程中MMP-2的表达增高,而TIMP-2的表达水平显著低于MMP-2，从而使MMP-2的活性得不到抑制，而促进肝纤维化的不断形成和发展。

2.3 MMP/TIMP对肝纤维化的调控 肝纤维化的发病机制复杂，多种因素均可能诱发肝纤维化。目前研究认为，肝纤维化的发生与消退是由多种细胞因子与信号通路构成的复杂网络共同调控的[16]。MMP/TIMP对肝纤维化形成与消退的影响与巨噬细胞关系密切，巨噬细胞在不同趋化因子的影响下可形成M1/M2型两种类型的巨噬细胞，进而影响ECM的合成和水解[17]。另外，活化的HSC中TIMP-1的表达上调，MMP的活性受到抑制，ECM的降解减少，最终形成了ECM的过度沉积，进而导致肝纤维化的发生。而M1型巨噬细胞则在胶原纤维的溶解中起着重要作用。M1型巨噬细胞分泌MMP-9，可以通过调控HSC的凋亡，减少TIMP-1的分泌进而增强MMP的活性，以促进ECM的降解，另外M1型巨噬细胞还可以分泌MMP-13、MMP-12等细胞因子，增强对ECM的水解作用，进而抑制肝纤维化的进程[17]。

MMP与TIMP在肝脏中维持着一种平衡的状态，当有过量ECM产生时， MMP会将其降解，同时TIMP又适当抑制着MMP的活性，不至于损伤正常肝脏组织，两者共同维护着肝细胞微环境的稳态。一旦有致病因子打破这种统一，则使两者失衡，从而导致肝纤维化的形成与发展。

3 基于MMP/TIMP发挥抗肝纤维化作用的药物

随着对MMP/TIMP在肝纤维化机制中的认识，基于MMP/TIMP发挥治疗肝纤维化的药物研究逐渐增加，不少现代药理学研究表明，许多药物可以通过影响肝组织中MMP/TIMP的表达来减缓肝纤维化的进程，从而发挥抗肝纤维化的作用。本综述从实验模型对MMP/TIMP的影响等方面将近5年报道的组分整理汇总，以期为阐明不同组分发挥抗肝纤维化的作用机制提供支持。

3.1 基于MMP/TIMP发挥抗肝纤维化作用的化学药物 由于肝纤维化发病机制的复杂，针对单一靶标研发的药物在临床很难奏效，截至目前尚无疗效明确的化学药物或生物药物可供临床应用。但近年来有实验研究发现美洛昔康、尼洛替尼及氯沙坦3种药物可能通过调节MMP/TIMP而在肝纤维化模型上发挥治疗作用。Hassan等[18]基于CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型研究发现，美洛昔康通过降低模型组大鼠中TIMP-1、TGFβ的表达而抑制胶原的沉积进而减轻肝纤维程度。据Karimi等[19]学者研究，尼洛替尼和氯沙坦联用通过上调CCl4诱导的肝纤维化大鼠中MMP-2、MMP-9的表达发挥抗肝纤维化作用。

3.2 基于MMP/TIMP发挥抗肝纤维化作用的中药 中药在治疗肝纤维化方面较西药更具优势，其多环节、多靶点的作用特点使之成为了肝纤维化药物研究的热点[20]。近年在中药复方的实验研究中，李洁等[21]基于CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型，发现加味茵陈四逆汤可以通过上调MMP-1及下调TIMP-1、TIMP-2的表达而减轻肝纤维的程度。李绍民等[22]研究认为，逍遥散含药血清可使体外肝纤维化模型细胞表现出MMP-1上调及TIMP-1下调。另有研究[23-25]表明，柴胡疏肝散、鳖甲煎丸及清肝九味丸可以通过下调TIMP-1及上调MMP-2、MMP-9的表达发挥抗纤维化的活性。

除中药复方外，单味中药在基于MMP/TIMP抗肝纤维化的实验研究中进展迅速，如荔枝核总黄酮、籽瓜皮提取物、金钗石斛多糖、鳖甲提取物、溪黄草黄酮、白背叶根水提物、豆荚提取物等均被报道有上调MMP及下调TIMP而减缓肝纤维化进程的作用[26-31]。

3.3 基于MMP/TIMP发挥抗肝纤维化作用的天然产物 近年来，从天然产物中寻找或发现抗肝纤维化药物和先导化合物已成为热门的研究领域。总结近5年的实验研究共发现14种天然产物可通过调控MMP/TIMP发挥抗肝纤维化的作用(表2)。这些天然产物在不同因素引诱的肝纤维模型中均可通过调控MMP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13或TIMP-1、TIMP-2的表达进而发挥抗肝纤维化的作用，此外这些组分还调节其他肝纤维化相关细胞因子(如TGFβ1、TNFα等)的表达进而影响肝纤维化的进程。

表2 近5年基于TIMP与MMP发挥抗肝纤维化的天然产物研究情况

综上，本文通过总结近5年来基于MMP/TIMP发挥抗肝纤维化作用的文献报道，共计发现相关药物30种，包括中药复方、单味中药及提取物、化学药物及天然产物等，从构成比来看，中药及天然产物相关组分在MMP/TIMP介导的纤维消融平衡中有重要作用， 该结果与文献报道的中医药治疗肝病尤其在肝纤维化防治领域疗效显著一致[47]。 从作用机制来看它们主要是通过不同程度的调节MMP/TIMP的表达，尤其是MMP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13与TIMP1/2等的表达而发挥抗肝纤维化的作用。总体来说，中药具有成分复杂、功效复杂等特点，与肝纤维化复杂的作用机制相适应，在肝纤维化的治疗上优势显著，不少研究也证实多种组分可以通过调控关键蛋白、关键靶标及相关信号通路减轻肝纤维化的程度。但仍有许多问题值得注意：(1)中药来源复杂、处理过程考究，因此某些活性物质的含量在不同研究中可能存在较大差异，会对不同研究结果的比较与分析造成一定的困扰。(2)由于肝纤维化的动物模型及体外实验研究的局限性，虽然抗肝纤维化药物的实验研究结果可观，但最终疗效及安全性仍需通过细致严格的临床实验验证筛选。(3)由于中药组分及功效的复杂性以及在治疗肝纤维化上的多层次、多靶点优势，使得阐明中药复方抗肝纤维化的机制仍具有极大的挑战。

4 总结与讨论

肝纤维化是多种肝病共同且可逆的病理过程，预防和治疗肝纤维化对于防控肝硬化及肝癌有重要意义。由于肝纤维化的发生和发展是由多种因子及信号通路共同调控，极具复杂性，而且动物模型的作用机制与人类肝纤维化的发病机制存在一定的差异性，故目前治疗肝纤维化的药物大都处于临床前的研究阶段，鲜有临床验证有效的药物。

但随着对肝纤维化作用机制研究的不断深入，MMP/TIMP在肝纤维化中的作用引起了学者们的广泛重视。现有研究发现MMP/TIMP可以不同程度地反映肝纤维化及肝硬化的进展情况，MMP/TIMP调控的胶原消融平衡，对早期诊断肝纤维化及逆转肝纤维化有着重要的意义；同时研究表明肝纤维化的治疗已经从抗炎治疗发展为以HSC为靶细胞的多模式结合治疗。ECM的沉积是肝纤维化的一个重要特征，MMP可以降解ECM的不同组分，其天然抑制剂TIMP能与MMP的成员发生不同形式的结合而抑制其活性，通过抑制胶原合成及促进胶原的降解减少ECM的沉积，进而减慢肝纤维化的进展或逆转肝纤维化。但目前MMP/TIMP在肝纤维化发生发展过程中对ECM的调控作用、如何精准维持MMP/TIMP、调节MMP的活性、阐明MMP/TIMP平衡的机制等方面还需深入研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：黄倩、杨燕对研究的思路或设计有同等的关键贡献；曾锐、张馨月、姚孟林参与了研究数据的获取分析解释过程；孙琴起草或修改文章关键内容。