液液萃取联合固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中胆酸、脱氧胆酸和脱氢胆酸的残留量

曹 晨，王 敏，陈念念，谢婧荷，彭 雪，张庶冉，俞珉颉，郭德华

(上海海关 动植物与食品检验检疫技术中心,上海 200135)

胆汁酸是脊椎动物胆汁的重要成分,能够促进肠道对脂肪的消化和吸收,并有助于去除血液和肝脏中不通过肾脏排泄的内源性和外源性物质[1-3]。胆汁酸是一种新型的水产动物饲料添加剂,能有效改善水产动物对脂肪的利用,提高饲料转化率,维护水产动物肝脏健康[4-7]。然而存在一些尚待解决的问题,如外源性胆汁酸的添加是否会抑制内源性胆汁酸的分泌,外源性胆汁酸添加量的确定[8-10]以及可能引起的安全问题[11-12]等。2021年,韩国食品药品安全部发布了2021上半年进口水产品重点管理对象,要求水产品中脱氢胆酸检出量不得超过0.01 mg·kg－1。

目前国内关于胆汁酸检测的研究对象大多针对水产动物胆汁,而对于胆汁酸饲料喂养的水产动物,其肌肉组织中胆汁酸残留量的研究未见报道。鉴于此,本工作以养殖鱼为研究对象,以胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸为目标物,采用乙腈提取,液液萃取联合固相萃取净化,超高效液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量,以期为水产动物肌肉中胆汁酸的快速筛选和确证提供技术手段。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters TQ-S micro型超高效液相色谱-串联质谱仪;Eppendorf 5810R 型离心机;VORTEX-GENIE2型涡旋混合器;Elmasonic P 型超声振荡器;Waters HLB固相萃取柱(60 mg,3 mL),使用前分别用3 mL甲醇、3 mL水活化。

单标准储备溶液:1.0 g·L－1,分别取0.010 g(精确至0.000 1 g)胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸、胆酸-d4、脱氧胆酸-d4标准品,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,摇匀备用。其他质量浓度的标准溶液均由此溶液用50%(体积分数,下同)甲醇溶液逐级稀释制备。

混合标准溶液系列:取适量的单标准储备溶液,以50%甲醇溶液逐级稀释,配制成胆酸-d4、脱氧胆酸-d4质量浓度均为100μg·L－1,胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸质量浓度分别为10,50,100,200,500μg·L－1混合标准溶液系列。

胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸、胆酸-d4、脱氧胆酸-d4标准品的纯度均大于99%。

甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温30 ℃;流动相A为水,B为甲醇。梯度洗脱程序:0～2.0 min时,A由90%降至10%,保持2.0 min;4.0～4.1 min时,A由10%跳转至90%;4.1～5.0 min时,A 由90%升至95%。流量0.5 mL·min－1;进样量2μL。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,负离子扫描方式;多反应监测(MRM)模式;雾化气为氮气;喷雾电压－3 000 V,锥孔电压30 V;去溶剂气温度500 ℃;去溶剂气流量600 L·h－1;其他质谱参数见表1。其中,“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

称取鱼肉样品5.0 g于50 mL 离心管中,加入100μg·L－1混合内标溶液0.1 mL、乙腈20 mL,混匀后超声提取10 min,然后以4 500 r·min－1转速离心5 min,按照上述步骤重复提取一次。合并上清液,于40 ℃旋蒸至干。残渣用50%甲醇溶液1 mL超声溶解5 min,加入5 mL 正己烷混匀,以4 000 r·min－1转速离心5 min,弃掉正己烷层。保留相过HLB固相萃取柱,用3 mL 水淋洗,抽干小柱后用3 mL 甲醇洗脱。收集前5 mL 洗脱液,于40 ℃氮吹至干,残渣用50%甲醇溶液1 mL 溶解,过0.45μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

胆酸、脱氧胆酸和脱氢胆酸均微溶于水、略溶于乙醇,不能直接采用水溶解、提取。因此,试验考察了常用提取溶剂甲醇、乙腈、50%甲醇溶液、50%(体积分数,下同)乙腈溶液在提取不同时间(10,15,30 min)时的提取效果。结果显示:提取溶剂为50%甲醇溶液、50%乙腈溶液时,回收率为60.0%～70.0%,低于甲醇和乙腈的(回收率大于80.0%)。考察提取时间时发现,超声提取不小于10 min时,目标物均能被完全提取(回收率大于80.0%)。考虑到分析时间、后续净化等,试验采用乙腈提取样品10 min。

试验还比较了HLB 固相萃取柱和C18固相萃取柱对3种目标物的净化效果。结果显示:与C18固相萃取柱相比,HLB 固相萃取柱的洗脱效果较好,目标物的回收率均在80.0%～120%内,测定值的相对标准偏差(RSD,n＝6)不大于15%。收集前1,3,5,6 mL 洗脱液,进一步考察洗脱液体积对目标物回收率的影响。结果表明,目标物回收率随洗脱液体积的增加而增加,当洗脱液体积为5 mL,目标物的回收率达到90.0%以上,说明目标物已基本洗脱完全,继续收集洗脱液至体积为6 mL,回收率没有明显提高。综合考虑试剂用量及洗脱时间等因素,本方法选择收集前5 mL洗脱液进行后续试验。

采用以上优化的条件分析时,整个前处理过程耗时20～30 min,满足残留检测的要求。

2.2 流动相的选择

比较了20 mmol·L－1乙酸铵溶液-乙腈、甲醇-水体系作流动相时的色谱分离效果。结果显示:以20 mmol·L－1乙酸铵溶液-乙腈体系作流动相时,目标物的色谱峰存在脱尾现象,且响应值偏低;以甲醇-水体系作流动相时,虽然保留时间增加,但峰形较好、响应值较高,3种目标物均得到了良好分离。因此,试验选择以甲醇-水体系作为流动相。

在优化的色谱条件下,0.01 mg·L－1各标准溶液的MRM 色谱图见图1。

图1 胆酸、胆酸-d4、脱氢胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸-d4 标准溶液MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of standard solutions of cholic acid,cholic acid-d4,dehydrocholic acid,deoxycholic acid and deoxycholic acid-d4

2.3 质谱条件的选择

在考察扫描方式时发现,采用负离子模式可获得较高的质谱灵敏度,可能和胆酸、脱氧胆酸和脱氢胆酸为酸性化合物有关。以1.0 mg·L－1单标准溶液为待测对象,采用流动注射方式进样,在负离子模式下先进行母离子扫描,得到各目标物的准分子离子,调节质谱参数,使母离子的丰度达到最大。再进行二级质谱分析,选取丰度较大、干扰较小的两对子离子作为定性、定量离子,再优化毛细管电压、碰撞能量和碎裂电压等质谱参数,使各目标物的准分子离子和特征碎片离子丰度达到最大,所得质谱参数见表1。

2.4 定量方法的选择

胆酸及脱氧胆酸均有相应的同位素内标物,而脱氢胆酸没有,因其结构与脱氧胆酸的类似,所以可用脱氧胆酸-d4作为其内标物来进行定量。试验比较了采用内、外标定量时各目标物的回收率和精密度。结果显示:使用外标法定量时,基质效应影响较大,回收率为60.0%～70.0%,测定值的RSD(n＝6)大于20%;当使用内标法定量时,不仅检出限满足要求,而且不同鱼肉中目标物的回收率在80.0%～120%内,测定值的RSD(n＝6)不大于15%,显著优于外标法的定量结果。因此,试验选择以内标法定量。

2.5 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标进行线性拟合。结果显示,各目标物标准曲线的线性范围为10～500μg·L－1,其他线性参数见表2。

表2 线性参数Tab.2 Linearity parameters

鉴于我国还没有水产品中这3种目标物残留量的规定,参考韩国对脱氢胆酸限值的规定(0.01 mg·kg－1),将这3种目标物的检出限和测定下限确定为0.003,0.01 mg·kg－1。采用阴性样品加标的方法验证了以上数值,所得信噪比(S/N)分别达到了不小于3,10的要求。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对阴性巴沙鱼、鳞鲀鱼样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平进行6次重复测定,计算回收率和测定值的RSD,结果见表3。

由表3 结果可知,3 种目标物的回收率为82.2%～115%,测定值的RSD 为2.6%～14%,说明本方法的准确度和精密度均较好,符合残留检测的要求。

表3 精密度和回收试验(n=6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n=6)

本工作以乙腈超声提取鱼肉中的胆酸、脱氧胆酸和脱氢胆酸,以液液萃取联合固相萃取净化样品,以超高效液相色谱-串联质谱法测定残留量,该方法检出限低,精密度和准确度好,适合鱼肉中相关物质的定量检测。