高效液相色谱法测定柑橘中喹啉铜的残留量

陈显柳，谢德芳，陈博钰，韩丙军

(中国热带农业科学院分析测试中心 国家市场监管重点实验室(热带果蔬质量与安全)农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室 海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室,海口 571101)

喹啉铜是一种广谱、高效、低残留的喹啉类低毒杀菌剂,属于有机铜鳌合物,同时具有喹啉和铜盐的效用,主要用于防治柑橘的溃疡病、马铃薯的早疫病、黄瓜的霜霉病、杨梅树的褐斑病等植物病害,对水果、蔬菜的细菌、真菌性病害均具有良好的预防和治疗作用。农作物在喷施喹啉铜后,其表面可形成一层严密的保护药膜,药膜会缓慢释放铜离子,被萌发的细菌孢子吸收,吸收至一定浓度水平时,孢子细胞即可被杀死,从而有效抑制病菌的萌发和侵入,达到防病治病的目的[1-2]。目前,国内登记在册的喹啉铜农药产品有31 种,包括原药、可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂,主要登记在册的农作物有柑橘、番茄、葡萄、辣椒、黄瓜、马铃薯、苹果和梨等。随着国家对食品安全的重视,高效、低毒的喹啉铜将得到更多市场推广应用,由此可能产生相关产品的过量使用。过量使用喹啉铜不仅会造成环境污染,还会导致铜离子在生物体内富集,进而对人体健康产生威胁。当前只有日本规定了喹啉铜在柑橘中的残留限量(5 mg·kg－1),而中国[3]、国际食品法典委员会(CAC)和欧盟均未对此进行相关规定。在此背景下,有必要开发快速准确地测定农作物中喹啉铜农药残留量的方法,为喹啉铜残留风险分析评价和农产品质量安全监管提供技术手段。

农作物中喹啉铜农药残留量的测定方法主要为气相色谱法[4-5]、液相色谱法[6-14]和液相色谱-质谱联用法[15]。气相色谱法前处理操作复杂,易导致喹啉铜损耗,且时间和试剂消耗过大,不适合大批量样品的处理。液相色谱法为使用较多的方法,如文献[4]在酸性条件下,用乙二胺四乙酸(EDTA)溶液将喹啉铜转化为8-羟基喹啉,再通过附火焰热离子检测器(FTD)的气相色谱法测定其含量。文献[6]采用乙腈和盐酸提取和净化稻田水、土壤和水稻样品,以添加了十二烷基硫酸钠和磷酸二氢钠的流动相进行洗脱,以高效液相色谱法(HPLC)测定喹啉铜的残留量。文献[7]简化了前处理流程,使用PCX 混合阳离子交换固相萃取柱富集西瓜中的喹啉铜,再以超高效液相色谱法测定其含量。文献[8]采用分散固相萃取法富集和净化,以含十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱,以液相色谱法测定黄瓜中喹啉铜的残留量。可以看出,液相色谱法多采用含十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液作流动相,若长期使用该流动相,可能造成色谱柱和色谱系统的损伤,测试成本较高。

柑橘可作为水果食用,也可制成药物入药,但目前还未发现柑橘样品中喹啉铜残留量分析的相关研究。鉴于此,本工作以体积比为1∶9的0.1%(体积分数,下同)三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液作为提取剂和流动相,以石墨化碳黑(GCB)作为净化填料分离基质,以HPLC 测定柑橘全果、橘肉和橘皮中喹啉铜的残留量。该方法前处理过程简单、准确度高、重现性好、分析时间短,可为柑橘中喹啉铜农药残留的研究提供科学的方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪,配2489型紫外检测器;CR22N 型台式高速冷冻离心机;RV8型旋转蒸发仪;Milli-Q 型超纯水机;XW-80A 型微型涡旋混合仪;T25型植物组织捣碎机;TTL-DCII型氮吹仪。

喹啉铜标准储备溶液:100 mg·L－1,取10 mg喹啉铜,用流动相超声溶解并定容至100 mL,摇匀备用。

喹啉铜标准溶液系列:取适量喹啉铜标准储备溶液,用流动相逐级稀释,配制成0.1,0.2,0.5,1.0,5.0 mg·L－1标准溶液系列,于4 ℃避光保存。

喹啉铜标准品的纯度为99.8%;乙腈、三氟乙酸为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Sun Fire®C18色 谱 柱(150 mm×4.6 mm,5μm);柱温25 ℃;流动相为体积比为1∶9 的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液;等度洗脱;流量1.0 mL·min－1;进样量10μL;检测波长254 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集和制备

1)柑橘全果样品 从4株柑橘树不同朝向的上、中、下、里、外等部位随机采集不少于12个果实,果实质量在2 kg以上,且生长正常、无病害。沿纵向将果实均匀切成4～8瓣(双数),分取不相邻的2～4瓣,放入植物组织捣碎机中进行匀浆。四分法缩分,分取150 g样品两份,分别装入样品容器中,贴好标签,贮存于－20 ℃冰柜中。

2)柑橘橘肉、橘皮样品 以上述方法采集并切开样品,分取不相邻的2～4瓣,分离柑橘橘肉和橘皮。将橘皮切成约2 cm×2 cm 的小块,放入植物组织捣碎机中匀浆,分取150 g样品两份,分别装入样品容器中,贴好标签,贮存于－20 ℃冰柜中。用植物组织捣碎机对橘肉进行匀浆,分取150 g样品两份,分别装入样品容器中,贴好标签,贮存于－20 ℃冰柜中。

1.3.2 样品的前处理和测定

称取5.00 g 柑橘全果、橘肉或橘皮样品于50 mL离心管中,加入3 g氯化钠和流动相10 mL,涡旋5 min,超声20 min,以3 800 r·min－1转速离心5 min,重复提取一次。合并上清液,分取5 mL于10 mL 离心管中,加入5 mg GCB 填料,涡旋2 min,以3 800 r·min－1转速离心5 min。分取4 mL上清液,于60 ℃旋转蒸发至近干,用流动相1 mL复溶,过0.22μm 水相滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

柑橘中含有丰富的黄酮类化合物、甘油糖脂、萜类化合物等,样品基质复杂。在选择提取剂时,首先尝试以乙腈作提取剂,但是所得喹啉铜色谱峰附近有杂峰干扰,而且响应值较低。考虑到喹啉铜可溶于强酸,而酸性较强的盐酸会对色谱柱和仪器造成损伤,试验选择在乙腈中加入0.1%三氟乙酸溶液,结果显示,当柑橘全果样品中喹啉铜的加标量为0.5,2 mg·kg－1时,回收率分别为83.6%和89.6%,且喹啉铜色谱峰附近无杂峰干扰,因此试验选择以体积比为1∶9的0.1%三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液提取柑橘基质样品中的喹啉铜。

2.2 净化填料的选择

柑橘基质复杂,若净化不完全,不仅色谱分离效果不佳,还会污染仪器。C18、N-丙基乙二胺(PSA)和GCB为常见的净化填料,其中C18为强疏水性吸附剂,对非极性、弱极性以及中等极性化合物具有广泛保留特性,可以有效去除油脂等物质;PSA 为固相吸附剂,可以有效去除脂肪酸、有机酸和一些极性色素、糖;GCB对果蔬中的色素具有很强的吸附能力。试验比较了以这3种填料净化加标样品溶液后喹啉铜的回收率,结果如图1所示。

图1 不同填料净化后喹啉铜的回收率Fig.1 Recovery of oxine-copper after purification with different packing materials

由图1可知:以C18填料净化时,喹啉铜的回收率为46.5%～76.7%;以PSA 填料净化时,喹啉铜的回收率为56.3%～86.3%;以GCB 填料净化时,喹啉铜回收率为83.5%～97.6%。只有以GCB 填料净化时,喹啉铜的回收率达到了农药残留分析的要求,因此试验选择以GCB净化样品。

进一步考察了GCB 用量对加标柑橘全果样品中喹啉铜回收率的影响,如图2所示。

图2 不同用量GCB净化后喹啉铜的回收率Fig.2 Recovery of oxine-copper after purification with different amounts of GCB

由图2可知,当GCB用量为5～50 mg时,柑橘全果样品中喹啉铜回收率随着GCB 用量的增加逐渐降低,推测GCB 与喹啉同为平面结构,两者具有较好的空间匹配度,根据选择性分子间作用力理论,喹啉铜可与GCB 相互作用而被吸附,GCB 用量越多,被吸附的喹啉铜就越多。因此,试验选择用5 mg GCB填料净化样品。

2.3 色谱行为

0.5mg·L－1喹啉铜标准溶液,柑橘全果、橘肉、橘皮阴性样品及加标样品(加标量0.5 mg·kg－1)的色谱图见图3。

图3 喹啉铜标准溶液以及阴性、加标柑橘样品的全果、橘肉、橘皮的色谱图Fig.3 Chromatograms of oxine-copper standard solution and negative and spiked citrus samples of whole fruit,flesh and peel

由图3 可知,喹啉铜的保留时间在3.5～4.5 min内,3种不同部位的柑橘基质均不干扰喹啉铜的测定。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件分析标准溶液系列,以喹啉铜的质量浓度为横坐标,其对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性拟合。结果显示:喹啉铜标准曲线的线性范围为0.1～5.0 mg·L－1,线性回归方程为y＝1.254×105x＋1.466×103,相关系数为0.999 7。

以阴性样品加标的方法确定检出限和测定下限,以不小于3倍、10倍信噪比对应的质量浓度作检出限和测定下限,所得结果分别为0.1,0.5 mg·kg－1。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对阴性柑橘全果、橘肉、橘皮样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n=5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表1可知,柑橘全果、橘肉、橘皮中喹啉铜的回收率为83.6%～95.6%,测定值的RSD 为2.3%～6.7%。

2.6 样品分析

按照试验方法分析实际样品,均未检出喹啉铜的残留。于当地市场采购40%(质量分数)喹啉铜悬浮剂,按照推荐剂量(稀释800倍)喷施柑橘树,施药2 h后,按照1.3节试验方法分析,在柑橘全果和橘皮样品中检出的喹啉铜残留量分别为为0.91,1.41 mg·kg－1,橘肉样品中未检出喹啉铜残留,满足柑橘样品中喹啉铜残留分析的要求。

本工作采用0.1%三氟乙酸溶液和乙腈的混合溶液作提取剂,采用GCB 净化样品基质,采用HPLC测定柑橘全果、橘肉和橘皮中喹啉铜的残留量,该方法干扰少、流动相温和对色谱柱损伤小、分析时间短,且精密度和回收率均满足残留分析要求,适用于测定柑橘全果、橘肉和橘皮中的喹啉铜残留量,也可为不同农作物中喹啉铜农药残留的分析提供依据和参考。