机制高温曲生产工艺的分析研究

王邦坤，刘民万，董伟杰，郑世武，张世文

（山东青州云门酒业(集团)有限公司，山东青州 262500）

制曲技术是我国特有的一份民族遗产，其历史尚不足500 年。曲为酒骨，制曲工艺是中国白酒工艺的重要组成部分。“自然富集、开放作业、堆积升温、翻转调节、排潮降温、总温控制”是大曲培养的共同机理。高温大曲要求在较高的温度下培养，以产生类似酱香的香气。熟悉大曲的生产特点，抓住关键环节，才能生产出优质高温大曲以保证产品质量。任何微生物的培养都受养料、水分、pH 值、氧气、温度等因素的影响，其中养料的不同和水分的大小对发酵的过程控制尤为明显。关注原料质量，在曲坯压制、曲房培养、出房贮存等阶段，结合生产实际探讨机制高温曲制作过程相关的技术问题。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：本研究用高温大曲为云门酒业制曲中心生产。

试剂：本研究所用试剂均为分析纯及以上级别，溶液均由蒸馏水配制。

仪器设备：GY-1500F 生化培养箱（常州华普达仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业公司）；XSP-2CA 显微镜（上海光学仪器）；CJ-2D-F 超净工作台（天津市泰斯特仪器公司）；7820 型气相色谱仪（美国Agilent 公司）；电子天平（上海津平科学仪器有限公司）；气质联用仪，配有EI 离子源，色谱柱型号：DB-FFAP 60 m×0.25 mm×0.2 μm；CAR/DVB/PDMS 萃 取 头(Agilent 7890-5975，美国)；高通量测序平台。

1.2 试验方法

1.2.1 试验流程

本研究采用流程如下：

原料质量鉴定→粉碎→母曲→加水拌料→压曲→晾曲→入房→翻曲→出房→贮存→使用

1.2.2 试验检测方法

1.2.2.1 感官质量鉴评及温度

小麦原料质量鉴定采用感官法；原粮粉碎度通过20 目筛进行测定；曲坯发酵温度及室温采用温度计法。

1.2.2.2 其他指标测定

大曲水分、酸度、糖化力、发酵力、液化力等参考标准QB/T 4257—2011，其中液化力、糖化力、酯化力测定具体方法如下。

1.2.2.2.1 液化力

方法提要：利用淀粉能与碘产生蓝色反应的特性，试样浸出液在35 ℃，pH4.6 溶液中酶解至试液对碘的蓝紫色特征反应消失。根据所需时间计算1 g 绝干曲在该条件下l h 能液化淀粉的克数，表示液化力的大小。

分析步骤：

5%酶液制备：根据测得的试样水分，称取相当于10 g 绝干试样量，精确至0.01 g，于250 mL 烧杯中，根据试样水分计算加水量，加pH4.6 缓冲液20 mL 后总体积为200 mL，充分搅拌。将烧杯置于35 ℃恒温水浴锅中保温浸渍1 h过滤备用。

测定：取20 mL 可溶性淀粉于试管中，加5 mL的pH4.6缓冲液摇匀，于35 ℃水浴中预热至试液为35 ℃时，加入10 mL 5%酶液充分摇匀并立即计时，定时用吸管吸取0.5 mL 反应液注入预先装了5 mL稀碘液的试管中起呈色反应，或将反应液放入盛有约1.5 mL 稀碘液的白瓷板中，直至碘液不显蓝色(或与标准比色液对比)为终点，记下反应时间t。

计算结果：

式中：X——试样的液化力，U；

20——可溶性淀粉毫升数，mL；

0.02——可溶性淀粉浓度，g/mL；

V——酶液定容体积，mL；

60——1小时之分钟数；

t——反应完结耗用时间，min。

1.2.2.2.2 糖化力

方法提要：大曲中糖化型淀粉酶能将淀粉水解生成葡萄糖。试样在规定条件下从淀粉的非还原性末端开始依次水解α-1,4-葡萄糖苷键产生葡萄糖，用斐林法测定所生成的葡萄糖量，以此来表示糖化力。

分析步骤：

大曲样液的制备(50 g/L)：根据测得大曲试样的水分，称取相当于绝干试样量10 g，精确至0.01 g放入250 mL 烧杯中，加20 mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加水，用玻璃棒搅拌均匀，定容至200 mL。将上述烧杯置于35 ℃恒温水浴中保温浸渍1 h，过滤，收集滤液，备用。

测定：于一试管内加入25.0 mL 可溶性淀粉溶液，再加5.0 mL 大曲样液，摇匀，加入20 % NaOH溶液l mL 后，吸取5.0 mL 作为空白溶液，用葡萄糖标准溶液滴定，记录其消耗体积V，操作程序同测定淀粉含量步骤；于另一试管内加入25.0 mL 可溶性淀粉溶液，再加5.0 mL 大曲样液，摇匀，置于35 ℃恒温水浴中，准确计时，糖化l h，加入20 %NaOH 溶液l mL 后，吸取糖化液5.0 mL 于盛有斐林溶液甲、乙液各5.0 mL 的锥形瓶中，加水10 mL，用葡萄糖标准溶液滴定，记录其消耗体积V，操作程序同测定淀粉含量步骤。

结果计算：

试样的糖化力按以下公式计算。

式中：X——试样的糖化力，U；

V——滴定空白时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL：

V——滴定试样时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；

2.5——每毫升葡萄糖标准溶液中含有葡萄糖的质量，mg；

30——糖化混合液(可溶性淀粉溶液加大曲样液)的总体积，mL；

0.25——5 mL大曲样液相当大曲的质量，g；

5——滴定时吸取的糖化液体积，mL。

1.2.2.2.3 酯化力

在规定的试验条件下，大曲中酯化酶催化游离有机酸与乙醇合成酯，再用皂化法测定所生成的总酯(以己酸乙酯计)，表示其酯化力。

分析步骤：

酯化样品的制备：吸取1.5 mL 己酸于250 mL锥形瓶中，加25.0 mL 无水乙醇，稍微振荡后，加入75 mL 蒸馏水，充分混匀。再称取相当于绝干试样量25 g，精确至0.01 g，加到锥形瓶中，摇匀后，用塞子塞上，置于35 ℃恒温箱内保温酯化7 d，同时做空白试验。

蒸馏：将酯化7 d后的试样溶液全部移入250 mL蒸馏瓶中，量取50 mL 乙醇溶液分数次充分洗涤锥形瓶，洗液也一并倒入蒸馏烧瓶中，用50 mL 容量瓶接受馏出液(外用冰水浴)，缓缓加热蒸馏，当收集馏出液接近刻线时，取下容量瓶，调液温20 ℃，用水定容，混匀备用。

皂化、滴定：将上述馏出液倒入250 mL 具塞锥形瓶中，加两滴酚酞，以氢氧化钠标准溶液中和(切勿过量)，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。再准确加入25.0 mL氢氧化钠标准溶液，摇匀，装上冷凝管，于沸水浴上回流0.5 h，取下，冷却至室温。然后，用硫酸标准溶液进行反滴定，使微红色刚好消失为其终点，记录消耗硫酸标准溶液的体积V。

结果计算：

试样的总酯含量(以己酸乙酯计)按公式(1)和公式(2)计算。

式中：A——测定总酯含量(以己酸乙酯计)，g/L；

C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

25.0——皂化时，加入0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

C——硫酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；

V——滴定时，消耗0.1 mol/L硫酸标准溶液的体积，mL；

0.1.2——与1.00 mL 氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相当的以克表示的己酸乙酯的质量

50.0——样品体积，mL；

A——试样总酯含量(以己酸乙酯计)，g/L；

A——未扣除空白试样所测总酯含量(以己酸乙酯计)，g/L；

A——空白试验所测总酯含量(以己酸乙酯计)，g/L。

试样的酯化力按下式计算：

式中：X——试样的酯化力(以己酸乙酯计)，U；

A——馏出液的总酯，g/L；

50——取样体积，mL；

2——大曲酶活单位折算系数。

1.2.3 原酒微量成分分析

1.2.3.1 GC-FID仪器分析

气相色谱仪，备有自动进样器和氢火焰离子化检测器(FID)；毛细管柱：CP-Wax 57 CB (50 m×0.25 mm×0.2µm)；载气(高纯氮)：流速1 mL/min，分流比：10∶1；氢气：流速为45 mL/min；空气：流速为450 mL/min；检测器温度：270 ℃；进样器温度：240 ℃。柱温：起始温度35 ℃，恒温6 min，以4 ℃/min 程序升温至60 ℃，以6 ℃/min 程序升温至110 ℃，恒温3 min，以6 ℃/min 程序升温至205 ℃，继续恒温13 min。

进样量：1 µL。采用内标法，内标物选用常用的叔戊醇、乙酸正丁酯、2-乙基丁酸。

1.2.3.2 GC-MS定量分析法

色谱条件：载气(高纯氦气)：纯度≥99.999 %，流速1 mL/min，分流比2∶1；起始温度50 ℃，保留2 min，然后以1.5 ℃/min升到85 ℃，再以3.5 ℃/min升到205 ℃，保留2 min。进样口温度260 ℃。

质谱条件：离子源230 ℃；传输线240 ℃；四级杆150 ℃；电子轰击源：70 eV；扫描范围：30～390 amu。定性采用全扫描模式(SCAN)，定量采用选择离子扫描模式(SIM)。

样品的制备和前处理方法：将目标酒样按标识的酒精度，用去离子水稀释到体积分数10%，吸取10 mL 稀释后的酒样置于50 mL 容量瓶当中,加入内标液使其终浓度为200 μg/L，然后用稀释后的酒样定容，吸取定容好的5 mL 样品放入20 mL 顶空瓶中,加入NaCl 3 g，旋紧瓶盖,置于55 ℃水浴锅中，预热10 min，恒温萃取40 min，萃取完毕后将萃取头取出,插入260 ℃进样口，解吸5 min。

1.2.4 菌种分析

高温大曲细菌、真菌群落结构分析采用高通量测序方法。

2 结果与分析

2.1 进厂原料质量鉴定（表1）

表1 原料检验结果

小麦淀粉含量高，麦胶蛋白和麦谷蛋白含量丰富，还含有少量葡萄糖、维生素及矿物质，是细菌、霉菌等微生物繁殖产酶的良好载体。据报道大曲发酵初期细菌89.3 %来自于原料（小麦）。软小麦虽然食用口感不佳，但质软易于微生物生长，踩制的曲子质量好。

制曲用小麦最好用陈麦，避免用新粮。刚收获的小麦，加水拌料后容易黏连，影响压曲操作及入房后的发酵控制；另一方面，新粮中夹有麦糠、秸秆等杂质，入曲仓后曲坯容易产生缝隙或内部空洞，使曲块产生裂纹，内部产生青霉等杂菌。

2.2 原料粉碎度（表2）

表2 原料粉碎度

粉碎过粗，培曲过程中曲块易掉边、干裂，水分易挥发，不挂衣，曲块易长毛霉、青霉，落温快，后火无力；粉碎过细，出房后水分不易排尽，会形成“沤心”“鼓肚”等现象。

小麦粉碎要形成“芯烂皮不烂”的梅花瓣，以释放淀粉，利于吸收水分，增大黏性。应根据小麦水分、新鲜度等调整钢磨，通过20 目筛进行测定，要求细粉占40%～50%。

2.3 拌料水分结果（表3）

表3 拌料水分结果

小麦内含水分一般＜12%，需要添加适量的净水以满足入房后制曲微生物生长繁殖的需求。高温曲拌料水分较浓香、清香曲稍大些，为39 %～40%。制曲最忌贪水，若曲坯水分大，则曲心内部水分、热量、气体通路被堵塞，易造成窝心曲、黑心曲，甚至招致大量细菌侵入，严重影响品质。水量的精准控制要求料准、水准、定速、定人、定检。

2.4 母曲添加结果（表4）

表4 母曲部分理化指标与菌属比较

机械制曲曲坯压制较紧，若母曲中耐热芽孢杆菌数量偏少，曲坯入房后升温缓慢发酵不均匀。由表4 可见，南方母曲含有的耐高温芽孢杆菌明显高于公司母曲，故将茅台镇优质大曲与公司母曲搭配使用，比例为6∶4，总量控制在5%～8%之间，所产高温大曲质量较好。

2.5 曲房温度培养结果（表5）

表5 高温大曲曲房培养记录表

入房后温湿度控制是重点。科学研究已表明，仓内湿度对大曲微生物生长繁殖的影响作用大于仓内温度，二者也是相互关联的。曲坯入房后，采用微机智能化控制曲房内温湿度品温，专人负责监控，适时调节仓内温度、湿度等发酵条件。曲坯各层间放置一定数量的木架，也能起到一定的隔离、调温调湿的作用。入房头几天主要是保湿促温，翻曲是散湿散温，高温期是控湿保温，二翻之后是散湿保温。

入房时间要趁早，采用多层排列方式，每层曲坯呈一字型排放。

第一次翻曲是制作高温大曲的关键，适时翻曲就是要做到火候恰到好处，这样的成品曲呈金黄色，曲香浓郁，并赋予原酒较多的香味物质。第二次翻曲一般在一翻7～9 d后。

曲堆上面的盖草不可过薄，不滴水即可。新旧稻草使用比例一般为4∶6，并洒适量温水保潮。稻草不但起了隔离曲块、调节曲块温湿度的作用，老稻草附着的酿酒微生物同时也起到了接种的作用。近来虽有不使用稻草、不翻仓、控温控湿制曲的报道，短期内尚无法替代稻草，稻草的重要性仍不容忽视。

2.6 高温曲贮存期间成分变化(表6)

表6 高温曲贮存期间成分变化

曲块发酵到期后，将其移入干燥、通风的贮曲库进行贮存、陈化。库房贮存4～6 月即可粉碎、使用。随着时间的延长，产酸细菌在干燥条件下逐渐干涸死亡，酵母数也呈下降态势。

2.7 强化大曲酿酒结果(表7)

表7 强化大曲酿酒应用结果 (μg/L)

利用微生物中心从高温大曲、酒醅、操作场地中分离、培养地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、红曲、放线菌等功能微生物，接种于曲料中进行强化大曲培养。经过试验的强化大曲用于酿酒，所产酒中β-苯乙醇、丁二酸二乙酯、糠醛、吡嗪类物质的含量有明显增长，突出了酱香型白酒的风格特征。

3 结论

从各阶段探讨高温曲制作工艺，从原料质量鉴定、粉碎度控制、拌料水分、母曲选用、温湿度调控、稻草使用、功能菌应用等方面精心培曲，制定合理的贮存期限。

经过持续的质量改进，不但明显提升了云门酱酿酒品质，大曲使用量也较以前降低了4 %～6%。公司目前正准备扩大制曲、酿酒生产能力及原酒存储能力以确保产品质量、满足市场需求。