西藏拉萨引种的4种竹子的耐寒性评价*

包昌艳，赵俊，杨汉奇

(1.中国林业科学研究院高原林业研究所，云南 昆明 650233；2.西藏自治区林木科学研究院，西藏 拉萨 850000)

近年来，随着西藏城市和国土绿化工作的深入开展，园林绿化建设事业得到了飞速发展，对于树种多样化的要求也越来越高。由于西藏地区特殊的高寒气候条件的影响，根据适地适树原则，选择耐寒耐旱的树种如高山松(Pinusdensata)、榆树(Ulmuspumila)、侧柏(Platycladusorientalis)和女贞(Ligustrumlucidum)等[1-3]是该地区绿化成功推进的关键。竹子是我国大众最喜爱的绿化观赏树种之一，也逐渐进入西藏城市绿化美化树种的选择范围。西藏自治区原生竹类有11属26种，其中特有种有19种[4-6]，一些竹种(如西藏箭竹Fargesiamacclureana)早已作为观赏树种在拉萨罗布林卡等园林中引种栽培[4]。为了提高西藏城市引种绿化观赏竹种的成功率和质量，开展不同竹种对西藏地区低温气候的耐寒适应性研究显得尤为重要和迫切。

植物应对低温胁迫的主要生理反应表现为膜脂氧化导致相对电导率及丙二醛含量(MDA)升高，游离脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等渗透调节物质的积累和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等保护酶活性被激活以抵御超氧自由基的毒害[7-10]。因而，这些生理指标已被用来评价苹果(Maluspumila)砧木[7]，椰子(Cocosnucifera)[8]，古巴牛乳树(Manilkararoxburghiana)、人心果(M.zapota)、神秘果(Synsepalumdulcificum)、蛋黄果(Lucumanervosa)和星苹果(Chrysophyllumcainito)5种山榄科(Sapotaceae Juss.)果树[9]，娜塔栎(Q.nuttallii)、沼生栎(Q.palustris)、舒玛栎(Q.shumardii)、双色栎(Q.bicolor)4个栎属(QuercusLinn)树种[10]等的抗寒性，以表征其耐寒性能。竹类抗寒生理研究结果显示，叶片相对电导率，POD、SOD等抗氧化酶活性，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和MDA含量的变化等都适合作为竹子耐寒性鉴定的关键生理指标[11-14]。杨振亚等[11]、胡尚连等[12]发现在相同低温胁迫下，耐寒性高的竹种在达到半致死温度前的叶片相对电导率、抗氧化酶活性和可溶性蛋白、脯氨酸等渗透调节物质含量较高。4个竹种在北方耐寒适应性试验中[13]，耐寒性差的早园竹(Phyllostachyspropinqua)的抗氧化酶SOD活性持续降低，POD峰值出现得更早；而且MDA含量大幅下降，可溶性糖含量在初期升高后出现下降趋势。在不同海拔高度分布的慈竹(Neosinocalamusaffinis)和毛竹(P.heterocycla)的耐寒能力比较中[14]，两个竹种叶片的净光合速率、POD活性和可溶性蛋白含量随海拔的升高而提高；而且随海拔的升高，耐寒性较差的慈竹中脯氨酸含量和可溶性糖含量随海拔的升高而增加，但对毛竹的影响不大。本研究以2018年3月从西藏引种的高山竹类西藏箭竹、错那箭竹(F.grossa)和从浙江引种的温带竹类紫竹(Phyllostachysnigra)、金镶玉(P.aureosulcataf.spectabilis)4个竹种为对象[15]，研究其在自然低温下耐寒相关生理指标的变化，探求这4个竹种的耐寒机理，并利用隶属函数法综合评价其抗寒性，以期为西藏耐寒竹类种质的挖掘和4竹种在拉萨市的引种及作为绿化竹种培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验地位于西藏自治区拉萨市林木科学研究院苗圃，海拔3 660 m，土壤为河滩砂壤。当地属高原温带半干旱季风气候，具有长冬无夏、春秋相连的特点。全年日照时间3 000 h以上；年平均气温7.5 ℃，历史最冷月平均气温-2.2 ℃，最热月平均气温16.5 ℃，极端最高温29.6 ℃，极端最低温-16.5 ℃；日温差大，年温差小，日均温≥10 ℃的日数为153.9 d，无霜期133 d；年降水量 443.6 mm，集中在6—9月份。空气稀薄，太阳辐射强，气温偏低，昼夜温差较大，冬春季干旱少雨，干湿季节分明且多大风[2,15]。

试验材料采集自引种定植2 a的西藏箭竹、错那箭竹(引自西藏)、紫竹和金镶玉(引自浙江)，4竹种分别作为当地原生高山竹类以及内地中小型温带竹类的代表竹种。采样期间气温变化情况如图1所示，8—11月，月平均气温逐渐下降，至次年1月达到最低平均气温0.45 ℃，之后气温慢慢回升；极端低温出现在11月份至次年3月份(气象资料来源于中国气象数据网http://data.cma.cn)。本试验分别于2019年8月、11月和2020年4月从各竹种中随机选取6个植株的上、中、下部枝条的成熟叶片混合后进行理化指标的测定，3次采样重复。3次采样时间段分别代表拉萨高寒地区竹类引种驯化过程中的3个阶段——提高植物耐寒性的准备阶段(8月)、低温驯化起始阶段(11月)和经历自然低温后的恢复生长阶段(第二年4月)。

图1 试验期间拉萨月平均气温与极端低温

1.2 叶片生理指标测定方法

5种低温胁迫下植物生理反应的关键指标被选择用来分析4种竹子耐寒性能。参照李合生[16]的指标测定方法，分别为：丙二醛(MDA)含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法；过氧化物酶(POD)活性，采用愈创木酚法；可溶性糖，采用蒽酮比色法；可溶性蛋白，采用考马斯亮蓝G-250染色法；游离脯氨酸，采用酸性茚三酮比色法。

1.3 数据处理

本试验数据经Excel 2010分析处理后，采用SPSS 20.0软件进行了方差分析(ANOVA，a=0.05)、相关性分析和聚类分析，分析各生理指标间的相关性，并将具有不同抗寒性的竹种进行分类。采用Canoco 5.0进行冗余分析(RDA)，以直观反映各生理指标变化与温度间的相关性。并运用模糊数学的隶属函数法对4种竹子各生理指标进行耐寒性综合评价。隶属函数值计算公式如下。

Rijk=(Xijk-Xkmin)/(Xk max-Xk min)(正相关)，

Rijk=1-(Xijk-Xkmin)/(Xk max-Xk min)(负相关)。

式中：i表示竹种，j表示月份，k表示指标；Xijk为i竹种在第j个月k指标的测定值，Xk min为所有竹种所有月份k指标的最小值，Xk max为k指标的最大值；Rijk为i竹种在第j个月k指标的隶属函数值[11,17]。

2 结果与分析

2.1 丙二醛含量变化

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的重要产物之一，它的产生会加剧膜损伤。4个竹种叶片中MDA含量随气温变化均呈现先升高后降低的变化趋势(图2A)，各个竹种的MDA含量都在第二阶段(11月)达到最大值。其中：错那箭竹的MDA含量在3个时期间变化不明显(P>0.05)；金镶玉3个时期间的MDA含量差异均达显著水平(P<0.05)；西藏箭竹与紫竹第一阶段(8月)的MDA含量与第三阶段(次年4月)的无显著差异(P>0.05)；西藏箭竹、紫竹和金镶玉第二阶段(11月)的MDA含量均显著(P<0.05)高于其余2个阶段(8月、翌年4月)的，3个竹种第二阶段(11月)的MDA含量比第一阶段(8月)的分别增加10.68%、11.70%和18.78%。另外，紫竹的MDA含量显著高于同期其它3个竹种的(P<0.05)，增加幅度为38.37%～68.33%。

2.2 保护酶活性变化

过氧化物酶(POD)是植物组织中重要的保护酶，低温条件下植物体内的保护酶活性常常能够被诱导而大量表达。8月后随着气温的降低，4种竹子叶片中POD酶活性变化差异明显(图2B)。错那箭竹的POD酶活性在3个时期间均无明显差异， 西藏箭竹、紫竹和金镶玉第二阶段(11月)的POD酶活性与第一阶段(8月)的相比，均显著增加，分别增加了6.28%、12.97%、10.54%；紫竹和金镶玉POD酶活性整体水平明显高于西藏箭竹和错那箭竹，整体高出62.02%～66.51%。

图2 自然低温环境对4种竹子叶片生理指标的影响

2.3 渗透调节物质含量变化

脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖为细胞渗透调节物质。4种竹子叶片组织中细胞渗透物质含量变化如图2C～图2E所示。西藏箭竹和错那箭竹3个时期间的可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的变化趋势，都在第二阶段(11月)时达最大值；而紫竹和金镶玉的的可溶性蛋白含量在3个时期间则呈先降低后升高的变化趋势，都在第二阶段(11月)时达最低水平(图2C)，这可能是由于持续低温抑制了这两种竹子蛋白质的合成。其中：紫竹可溶性蛋白含量在3个时期间变化不明显(P<0.05)；西藏箭和金镶玉第一阶段(8月)的可溶性蛋白含量含量与第三阶段(翌年4月)的无显著差异(P>0.05)；错那箭竹可溶性蛋白含量在第二阶段(8月)与第三阶段(翌年4月)变化不明显(P<0.05)；西藏箭竹和错那箭竹第二阶段(11月)的可溶性蛋白含量比第一阶段(8月)显著增加23.57%和20.00%，紫竹和金镶玉第二阶段(11月)的可溶性蛋白含量则比第一阶段(8月)降低12.71%和24.00%。另外，紫竹的可溶性蛋白含量明显低于同期其他3个竹种的(P<0.05)，与西藏箭竹和错那箭竹相比，紫竹的可溶性蛋白含量平均低出7.19%～81.31%。

4种竹子叶片的可溶性糖含量(图2D)和脯氨酸含量(图2E)随气温变化都呈现先升高后降低的变化趋势，且都在第二阶段(11月)达较高水平。其中，西藏箭竹和错那箭竹的可溶性糖含量在第一阶段(8月)和第三阶段(翌年4月)差异不显著(P<0.05)，而紫竹和金镶玉的可溶性糖含量在3个时期间变化明显(P<0.05)；脯氨酸含量仅错那箭竹在3个时期间变化显著(P<0.05)，其余3种竹的脯氨酸含量在第一阶段(8月)和第二阶段(11月)变化显著(P<0.05)。与第一阶段(8月)相比，西藏箭竹、错那箭竹、紫竹和金镶玉第二阶段(11月)叶片中的可溶性糖含量分别显著提高10.89%、10.25%、11.66%、20.14%，脯氨酸含量则分别显著增加7.73%、3.47%、5.69%、11.98%。此外，3个时期西藏箭竹和错那箭竹的脯氨酸含量远高于紫竹和金镶玉，平均高出57.01%～133.14%，这可能暗示西藏箭竹和错那箭竹有更强的抗寒性。

2.4 自然低温对4种竹子生理指标影响的相关分析和冗余分析

2.4.1 相关性分析

自然低温下4个竹种生理指标的Pearson相关分析如表1所示。可溶性蛋白含量与MDA含量、POD活性极显著负相关，相关系数分别为-0.838、-0.684，可溶性糖含量则相反，与MDA含量、POD活性显著正相关，相关系数分别为0.723、0.675；二者之间及二者与脯氨酸含量间均无显著相关关系。POD活性与MDA含量呈极显著正相关(0.769)，与脯氨酸含量呈极显著负相关(-0.914)，其他指标相关性不显著。由于各变量之间存在一定的相关性，使得观测数据所反映的信息存在重叠现象[18]。因此在竹子耐寒性评价中，不能单独依据上述某个或某两个指标对耐寒性进行评价。

表1 4个竹种耐寒性指标相关系数矩阵

2.4.2 冗余分析

冗余分析(RDA)结果(图3)显示：可溶性糖(SS)与MDA、POD活性呈正相关关系，与可溶性蛋白(SP)、脯氨酸(Pro)间表现出负相关关系，Pro与SP间呈正相关，MDA、POD也呈正相关关系，与上述Pearson相关分析结果基本一致。温度的改变对SS(可溶性糖)的影响最大，对MDA、POD活性影响次之，而对Pro(脯氨酸)、SP(可溶性蛋白)的影响相对较小。

图3 竹子叶片耐寒性指标对月平均温度响应的冗余分析(RDA)

2.5 竹子耐寒性分类及综合评价

2.5.1 聚类分析

聚类分析是种质资源评价和性状评价中一种高效、通用的分析方法[19]。对4个竹种叶片耐寒生理指标的聚类分析结果显示，基于组间联接法(欧氏距离)可形成两大聚类，紫竹和金镶玉聚为一类，西藏箭竹和错那箭竹构成另一类，表明紫竹和金镶玉、西藏箭竹和错那箭竹在耐寒表现上分别具有相似性(图4)。

图4 基于5个耐寒生理指标的4个竹种的聚类分析

2.5.2 隶属函数综合评价

植物耐寒性是由多种数量性状和质量遗传基因等综合作用的累加结果，因此运用隶属函数法将4种竹子叶片的耐寒性相关生理指标进行综合分析，评价其耐寒性的结果更为可靠。根据隶属函数值可知，4种竹子的平均隶属度为0.437 3～0.633 0，错那箭竹的平均隶属度最高(0.633 0)，西藏箭竹的平均隶属度次之，紫竹最低(0.437 3)(表2)。因此，4种竹子耐寒性综合排名为：错那箭竹>西藏箭竹>金镶玉>紫竹。

表2 4种竹子的隶属函数值及耐寒性综合排名

3 讨论与结论

温度是影响植物生长发育和地理分布的主要自然环境因素之一，植物在引种驯化过程中，常通过自身生理和形态的可塑性提高对环境的适应性。而植物叶片对气候变化非常敏感，以植物叶片为研究对象，更能反映植物对气候变化的响应与适应机制[20]。本研究中，在自然低温下，引种的4种竹子叶片中的MDA含量、POD活性、可溶性蛋白和可溶性糖含量等生理指标发生了明显变化，且不同竹种间各指标也有一定差异，反映了竹子对低温的生理响应；其中，耐寒性强的竹种MDA含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量与耐寒性差的竹种相比差异明显，提示它们在4种竹子耐寒过程中可能发挥着重要作用。

植物膜系统是植物受低温伤害的原发部位，低温胁迫下，MDA大量积累会造成膜透性上升，膜内物质外渗，导致细胞膜系统严重受损[7,21]。低温条件下，耐寒性较差的树种细胞膜氧化现象往往发生得更早更严重，这导致其MDA含量的显著增加[12]。本研究中4种竹子MDA含量在自然低温驯化后均有不同程度的增高，与橡胶树无性系在自然越冬过程MDA含量变化一致[22]；其中耐寒性差的紫竹和金镶玉MDA含量增幅较大(11.70%和18.78%)，耐寒性强的错那箭竹在温度降低后则无显著变化，这与张海燕[23]在欧美杨(P.×euramericana)中的研究结果相似，显示错那箭竹膜系统耐寒性强于其他种。此外，紫竹MDA含量明显高于同期的其他3种竹，提示紫竹在西藏耐寒适应性较差。

POD活性上升有利于保持植物体内自由基的产生与清除之间的平衡，从而保护细胞膜结构，增加其抗寒能力。已有竹类相关研究发现POD、SOD等抗氧化酶活性在一定低温条件胁迫下随温度的降低而升高，表明抗氧化酶系统在竹子耐受低温的过程中发挥积极的作用[11-12]。本研究中自然低温驯化后各竹种POD活性不同程度的升高反映了它们对低温的生理响应，与前人研究结果一致[11-13]。其中，错那箭竹和西藏箭竹POD活性在拉萨定植并经自然低温后增幅较小，而从内地引种的紫竹和金镶玉的POD活性则保持了较高水平，这可能是由于错那箭竹和西藏箭竹是西藏地区原生的高山竹种，本身具有较强耐寒性的生物学特性，低温胁迫对它们的影响较小，因而在POD活性变化上也较小。

渗透调节作用是植物抵御低温胁迫的重要生理机制，可溶性蛋白质、可溶性糖和游离脯氨酸的积累能增加细胞内束缚水与自由水的比值、原生质的保水能力和细胞液浓度等，从而平衡在低温条件下的细胞代谢，对生物膜系统起到很好的保护作用[11,24-26]。本研究发现，4个竹种可溶性糖含量和脯氨酸含量随气温变化都表现先升高后降低的变化趋势，并在第二阶段(11月)达较高水平，耐寒性强的西藏箭竹和错那箭竹经低温驯化后可溶性蛋白含量显著增加(23.57%和20.00%)，西藏箭竹和错那箭竹的脯氨酸含量远高于紫竹和金镶玉，平均高出57.01%～133.14%，说明不同程度的可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加是竹子在低温条件下的适应性策略，这与前人的研究一致[11-14,27]。但耐寒性弱的紫竹和金镶玉经低温驯化后，可溶性蛋白不增反而显著降低，这可能与持续低温对耐寒性差的竹子产生严重的冷害，超出其耐受范围，导致细胞内渗透失衡，蛋白质含量下降有关[8]。

相关分析和冗余分析(RDA)分析结果显示，在自然低温过程中，温度的改变对4种竹子中叶片耐寒性生理指标的影响存在不同程度的差异，且各生理指标间也存在相关性，用其中某单一指标来评价竹子的抗寒性存在偏差。植物耐寒性是多重因素综合作用的结果，故本研究运用隶属函数法对引种竹种的耐寒性进行综合评价，4种竹子在拉萨的耐寒性强弱顺序为：错那箭竹>西藏箭竹>金镶玉>紫竹，这与近年来在拉萨市引种栽培试验结果一致[15]。

综上所述，自然低温对4种竹子的叶片耐寒性生理指标均有不同程度的影响，且各指标间存在相关关系，耐寒性为多重因素综合作用的结果，运用隶属函数法评价4种竹子的耐寒性具有更高的可信度。4种竹子在拉萨的耐寒性以错那箭竹最强，西藏箭竹次之，金镶玉较弱，紫竹最弱。西藏拉萨地区气候寒冷干燥，冬季长达5个月，因此，在拉萨进行绿化竹子引种时应优先考虑当地的错那箭竹、西藏箭竹等耐寒性较强的高山竹种。