藻菌生物膜对废水Cu2+吸附及其胞外聚合物变化研究

任芸芸，胡文杰，张 莎

(1.铜川职业技术学院，陕西 铜川 727031；2.横河电机（中国）有限公司，陕西 西安 710075；3.陕西科技大学，陕西 西安 710021)

0 引言

我国工业发展迅猛，对于原材料及产品生产能力的需求日益增多，而由此产生的资源开采和后续产业排放引起的环境问题也愈发严重，其中重金属污染由于毒性强、存在期长最引人担忧[1]。Cu 作为典型的重金属污染物，由于其使用范围广泛，成为了最严重的重金属污染之一[2]。 虽然微量Cu 是生物体生长发育的必须元素，但浓度过高时将会引起生物体代谢紊乱并进而形成毒害作用[3]，并通过水流冲刷以及随水流向下渗透等方式进入地球的水循环，并最终通过生物链超量累积于生物体内，对生物体造成长期毒害作用[4]。 因此，近年来对Cu 污染水体的有效处理已经逐渐引起关注。

重金属污染水体的修复的方法主要有3 类：物理、化学及生物修复法。 其中，生物修复法由于修复成本低、 环境友好性强以及无二次污染等优点而受到广泛关注[5]。 CHOI Y S 等[6]研究利用蚯蚓处理含Cu 和Hg 的泥土，结果表明处理后污泥中的Cu 含量降低了23.86%。 杨世勇等[7]研究发现高山甘薯可以有效富集Cu，富集量可达12 300 mg/kg。 李影等[8]研究了蕨类草本植物对Cu 的富集作用，结果表明节节草和蜈蚣草分别具有耐性强和生物量大的优点，是Cu 污染修复的理想植物。 近年来兴起的重金属藻类修复技术逐渐被寄予厚望[9-10]，其对比一般植物修复及微生物修复技术，更具有繁殖快、易回收及吸附量大等优点。 马艳等[11]利用藻菌生物膜处理铅锌尾矿渣中的重金属，结果表明，藻菌生物膜可以通过胞外聚合物 （EPS） 与重金属的络合来吸附重金属，其中对Pb2+的吸附能力最强。目前的研究已证明了藻类及藻菌生物膜对部分重金属具有良好的去除效果。研究拟利用城市自然水体，通过富集培养及挂膜制备藻菌生物膜，并对含Cu2+模拟废水进行处理，以验证藻菌生物膜对Cu2+的吸附效果及其胞外聚合物的变化，可为Cu 污染水体的生物修复提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

藻菌富集培养及挂膜所使用原始水样取自西安市长乐公园芙蓉湖。

1.2 实验设置

过高浓度的重金属将对微生物产生胁迫毒害作用，因此在研究中一般设计ρ（Cu2+）为0.5～30 mg/L[12-13]。 各因素对Cu2+吸附影响的实验设置如下：

（1）pH 值

模拟废水ρ（Cu2+）为1 mg/L，室温，pH 值分别为：3，4，5，6，7，8，9，共7 个梯度，处理第2 天取样检测Cu2+浓度；

（2）温度

模拟废水ρ （Cu2+） 为1 mg/L，温度分别为：25，30，35，40，45 ℃，共5 个梯度，处理第2 天取样检测Cu2+浓度；

（3）初始浓度

模拟废水ρ（Cu2+）初始分别为1，5，10，15，20 mg/L，共5 个梯度，室温，处理第3 天取样检测Cu2+浓度、多聚糖及ATP 含量；

（4）吸附时间

模拟废水ρ（Cu2+）为1mg/L，室温，在运行前取样，并在之后每隔1 d 取样检测Cu2+浓度、多聚糖及ATP 含量。 并设置ρ（Cu2+）=0 mg/L 为空白对照组。

上述实验中每个处理设置3 个重复组；

（5）连续吸附实验

模拟废水ρ（Cu2+）为16 mg/L，反应器有效容积为16 L，其中含有6 串挂好膜的填料，利用蠕动泵连续进水及出水，流速为50 mL/h，室温，每隔1 d 取样检测Cu2+浓度，实验装置见图1。

图1 含Cu2+废水连续处理装置示意

1.3 实验流程

（1）藻菌富集培养及挂膜

取回一定量水样后，在容积为20 L 的有机玻璃圆桶中进行培养。 培养条件为：自然光照下室温（夏季）培养，用空压机进行曝气，同时加入16 L 灭菌后的液体培养基供培养生物膜用（培养基成分：每升培养基包含灭菌米汤水100 mL，Ca(NO3)2·4H2O 0.25 g；NaCl 0.3 g； MgSO4·7H2O 0.05 g；KH2PO40.05 g；ZnSO4·7H2O 0.05 g；NaHCO30.02 g；FeCL3，MnCl2，Na2MoO·H2O，CuSO4·5H2O 痕量），之后每10 d 加1次培养基至原水位线。 培养1 个月后用半软性填料挂膜15 d，得到藻菌生物膜备用。

（2）藻类鉴别

用压滴法[14]制作藻类的标本片，通过显微镜（CX41RF，奥林帕斯有限公司）放大1 000 倍观察。为便于采集生物膜样品，每片填料上平行悬置2 片载玻片。 载玻片使用前经洗涤剂浸泡24 h 后用去离子水清洗再放入质量分数为15%的硝酸溶液中浸泡24 h，重复2 次后用去离子水洗净。

（3）Cu2+浓度设置

使用CuSO4·5H2O（分析纯）配置质量浓度为1 000 mg/L 的浓缩液，然后在500 mL 培养所得菌液中加入相应量的浓缩液得到不同初始浓度的溶液。使用NaOH（分析纯）和HCl（分析纯）调节pH 值，采用pH 计（PHS-3C,北京普析通用仪器有限公司）测定pH 值，使用水浴加热锅调节运行温度。 开始运行时各处理组加入1 片挂好膜且长势相似的藻菌生物膜；

（4）Cu2+浓度及胞外聚合物含量测定

从反应器中取100 mL 水样，用镊子刮取载玻片上约2 cm3生物膜，一同放入离心机中在6 000 r/min转速，20 ℃条件下离心10 min，取上清液测水样中Cu2+浓度，并将离心后的生物膜分成2 份，分别称量重量并测定生物膜中多聚糖和ATP 含量。

1.4 检测方法

（1）Cu2+浓度测定采用火焰法[15]。取100 mL 水样放入150 mL 锥形烧杯中，加入硝酸5 mL，在电热板上加热消解（不要沸腾），蒸至10 mL 左右，再加入5 mL HNO3，2 mL HClO4，继续消解至1 mL 左右，取下冷却，并加水稀释至100 mL，过滤后用原子吸收光谱仪（AnaLyst 800，Perkin ELmer）测定其浓度。 同时做空白样；

（2）多聚糖的测定采用苯酚-硫酸法测定[16]。 将离心后的1 份生物膜放入10 mL 试管中加入1 mL去离子水并充分混合，加入质量分数为5%的苯酚溶液1 mL，摇匀后迅速加入5 mL 质量分数为95%的H2SO4在黑暗环境中反应10 min，反应结束后，再震荡10 s，最后将试管置于30 ℃水浴中10 min 后，使用紫外分光光度计（Tu-1901，肇庆市高能达化工有限公司）在490 nm 处比色测定吸光度，并根据标曲得出多聚糖浓度；

（3）ATP 的测定采用间接测定法[17]。 将离心后的1 份生物膜加入装有1 mL 去离子水的试管中，完全混合后加入2.5 mL 质量分数为95%的H2SO4，然后用纱布盖上、封严，置于温度128 ℃高压锅加压15 min 后取出，室温下冷却后，加1～2 滴质量分数为30%的H2O2溶液，摇匀，用2 mL 去离子水稀释，然后再给各管加定磷试剂3 mL，置于45 ℃水浴25 min，取出冷却至室温，在紫外分光光度计660 nm 处比色测定，并根据标准曲线得出ATP 浓度。

1.5 数据处理

利用DPS 7.5 进行数据分析；Origin Pro 8.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 藻菌生物膜的培养及鉴别

藻菌微生物的富集过程及后续挂膜过程见图2。

图2 藻菌生物膜图像

由图2（a）可以看出，藻菌微生物在富集30 d 后培养液颜色明显加深，说明微生物富集浓度显著提升，并通过软性填料成功挂膜，得到长势良好的藻菌微生物挂膜片。由图2（b）可以看出，通过1 000 倍放大显微镜对培养液中的微生物进行鉴定，发现此类微生物细胞呈现为椭圆形或球形，颜色表现为淡绿色，整体为无一定数目的群体或单细胞。 与《微生物的鉴别与图谱》 进行对比确认此类微生物符合绿藻门小球藻属微生物的典型特征。

2.2 不同处理参数对生物膜处理含Cu2+废水效果的影响

不同处理参数下藻菌微生物对含Cu2+模拟废水的处理效果见图3。

图3 各处理参数对生物膜处理含Cu2+废水效果的影响

由图3（a）可以看出，在Cu2+初始浓度为1 mg/L、温度为35 ℃条件下处理1 d，藻菌微生物对Cu2+的吸附效率随pH 值增加先升高后降低，在pH 值为5时达到最佳，吸附量为0.183 7 mg，去除率为36.73%，后续逐渐降低。 整体而言，酸性环境下的处理效果优于碱性条件；

由图3（b）可以看出，pH 值为7，微生物在35 ℃时具有最佳的处理效果，Cu2+吸附量为0.175 0 mg，去除率为34.99%； 当温度超过40 ℃后，微生物对Cu2+的吸附效率较低温时明显下降；

由图3（c）可以看出，当初始质量浓度不超过15 mg/L 时，微生物对Cu2+的吸附效率随初始质量浓度的升高而升高，在15 mg/L 时，吸附量达到最高，为2.565 8 mg；但当质量浓度超过15 mg/L 时，吸附效率明显下降；

由图3（d）可以看出，吸附效果随时间增加而升高，处理1 d 时Cu2+吸附最快，Cu2+浓度明显降低，Cu2+吸附量和去除率分别为2.303 mg 和57.59%，之后吸附量增速减缓，6 d 后分别为2.877 2 mg 和71.93%，此时模拟废液中ρ（Cu2+）为0.280 7 mg/L。

2.3 生物膜处理含Cu2+废水的动力学及拟合

对含Cu2+废水的动态处理过程进行动力学拟合，所采用的动力学模型方程及拟合参数见表1，拟合结果见图4。 一级动力学模型和二级动力学模型都能较好的验证数据，表明藻菌微生物膜可在3 d内较高效的处理含Cu2+废水。

表1 生物膜处理含Cu2+废水动力学拟合及参数

图4 生物膜处理含Cu2+废水的动力学拟合

2.4 含Cu2+废水对生物膜胞外聚合物的影响

处理含Cu2+废水的过程中，藻菌生物膜的胞外聚合物的变化见图5。

图5 藻菌生物膜的胞外聚合物的变化

由图5（a）可以看出，含Cu2+废水中的藻菌生物膜所具有的多聚糖含量相较空白水样明显增加，且随着处理时间增加，前者升高的幅度明显大于后者，在含Cu2+废水中处理至第4 天时，藻菌生物膜多聚糖含量达到最高，为1.915 mg/（mL·g），之后有所下降。

由图5（b）可以看出，藻菌微生物ATP 含量变化与多聚糖有所不同，含Cu2+废水中的藻菌微生物ATP 含量明显低于空白水样中。 且与空白水样中ATP 含量持续上升不同的是，含Cu2+废水中的藻菌微生物ATP 先降后升再下降，并在第4 天达到最高，为7.02 mg/（mL·g）。

由图5（c）可以看出，Cu2+初始浓度的增加将导致藻菌微生物多聚糖和ATP 含量持续下降。 分别由ρ（Cu2+）为1 mg/L 时的1.632 mg/（mL·g）和5.21 mg/（mL·g），下降至ρ（Cu2+）为20 mg/L 时的1.029 mg/（mL·g）和1.75 mg/（mL·g）。

综上所述，藻菌生物膜的胞外聚合物含量随处理时间增加而整体呈现升高的趋势，但随着Cu2+初始浓度的增加而表现出下降的趋势。

2.5 连续吸附含Cu2+废水试验

藻菌生物对含Cu2+废水进行连续吸附处理的出水效果见图6。

图6 连续吸附处理过程中出水Cu2+浓度变化

由图6 可以看出，在前10 d 内，出水Cu2+浓度受培养液稀释明显，出水浓度上升明显且波动较大，出水质量浓度从第1 天的0.205 mg/L 逐渐上升至第9 天的0.561 mg/L。 处理20 d 后，液体置换过程几乎完成，稀释效果降低，出水Cu2+浓度上升变缓慢且更稳定，ρ（Cu2+）从第20 天的0.523 mg/L 逐渐上升至第42 天的0.689 mg/L，并维持在该水平，此时Cu2+去除率约为95%。

3 讨论

微生物对重金属的去除效果受处理条件及参数的影响十分明显，处理参数及条件不仅影响微生物自身的代谢过程[18]，也影响着微生物重金属与重金属的结合过程[19]。 已经有研究证明，藻类对于重金属的吸附依赖于其细胞表面的自由位点数目，而自由位点数目受pH 值影响明显[20]。 当pH 值为5 时，藻菌微生物对Cu2+的去除率达到最高，当pH 值＞8时，其去除率迅速下降。 这是由于在低pH 值的情况下，pH 值的上升会引起细胞壁上的胺基、 酰基胺和羟基等表面官能团质子化减少，溶液中正电荷与Cu2+的竞争减弱，吸附量得以提升。但较高pH 值下，溶液中的金属离子又多以氢氧化物的形式存在，剩余Cu2+由于具有较强的电子结合能力而容易被周围阴离子包围，形成带负电的基团，从而显著降低藻类对水中铜离子的去除效果；另一方面，过高或过低的pH 值对微生物自身代谢的不利影响也决定了其不佳的吸附性能[21]。

微生物对环境温度较为敏感，合适的温度有利于其自身的代谢过程，并进一步影响其对重金属的吸附[22]。 本实验的结果表明，藻菌生物膜处理含Cu2+废水的最佳温度为30～40 ℃，在此温度区间内，微生物可以维持较高的活性，有利于吸附的进行。 一方面，当温度过高，微生物体内代谢物质发生不可逆的损伤，因此使其吸附Cu2+能力降低；另一方面，Cu2+在生物膜表面的吸附属于放热反应[23]，这也是温度升高，吸附量增加的原因之一。 但整体来看，微生物代谢对温度的敏感性才是影响其重金属吸附的主要因素。

藻菌生物膜对Cu2+的吸附量及去除率与溶液初始Cu2+浓度强烈相关。 在多数以微生物作为吸附剂的研究中[24]，都表现为随着溶液初始重金属浓度升高，吸附量先升高后下降，而去除率则持续下降。 这是由于在微生物对重金属的容忍范围内，重金属的浓度增加将提升结合位点吸附重金属的概率。 但当初始初始浓度超过微生物的容忍范围，微生物受到强烈的毒害作用而消亡，而作为抗胁迫作用而分泌的胞外聚合物也将急剧减少[25]。 同时，DLVO 理论[26]也提出，在合适的重金属浓度范围内，絮凝能力也会随离子强度的增加而加强，有利于重金属吸附，而在过高的浓度下则会产生重金属抗凝作用，减弱重金属的吸附。

对藻菌生物膜处理含Cu2+废水不同时间的研究表明了生物膜在24 h 内即可快速吸附Cu2+，并在后续6 d 内继续缓慢吸附。 同时，生物膜在Cu2+胁迫下得响应机制也可以从其胞外聚合物的变化趋势中观察到。 与无胁迫下对比发现，Cu2+胁迫下得生物膜多聚糖含量明显较高，而ATP 含量则明显较低，且胁迫下得多聚糖和ATP 含量都在4 d 内上升到最高点，后续缓慢下降。 这说明了Cu2+胁迫下，藻菌生物膜的受重金属毒性而生理活性较低，ATP 含量减少，此时，生物膜启动自身响应机制，分泌更多的多聚糖来抵抗重金属的毒性胁迫。 后续随着生物膜自身响应抵抗胁迫过程的进行，4 d 后ATP 含量逐渐回归正常水平范围，多聚糖的分泌活动也由顶峰逐渐减弱。有诸多研究已经证明，大多数植物及微生物都具有类似的协调响应抗胁迫机制来应对生存环境中的不利因素[27]。

4 结论

生物修复法由于其成本低廉、 环境友好性强等优点已成为当下重金属处理领域的热点。 本研究探究了通过城市湖水中藻类富集挂膜得到藻菌生物膜对含铜废水的处理效果，发现在温度为35 ℃，pH 值为5 时生物膜对含Cu2+废水处理效果最佳，生物膜最大Cu2+耐受质量浓度为15 mg/L，并在24 h 时可近似达到吸附平衡。 探究了生物膜连续处理含Cu2+废水，发现其具有良好的稳定性，处理50 d 时对Cu2+的去除率仍可达95%，，藻菌生物膜在含铜废水处理中具有良好的应用前景。