产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法优化发酵工艺

秦 昊 刘 凯 邓文玺 李 珊 于淑萍 王梦圆 郭东会

（山东第一医科大学生命科学学院，山东泰安 271016）

脂肪酶在人们的生产生活中发挥着重要作用[1]。脂肪酶可以提高一些食品添加剂的脂溶性，如抗坏血酸，从而可以使其更好地应用于脂类食品中[2-3]；在药物生产中，脂肪酶催化拆分手性药物[3]；在白酒生产中可以通过脂肪酶催化形成酯类化合物以增添白酒的风味[4]；在制革行业中需要进行脱脂、脱毛等操作，这些操作耗时耗力、人工成本高，若使用脂肪酶可以加快生产速度、减少成本[1]。

脂肪酶来源丰富，广泛存在于动物、植物和微生物中。其中细菌、真菌和酵母产生的脂肪酶活力很高，而且微生物繁殖迅速，因而具有比动植物源脂肪酶更广泛的作用pH值和温度范围[5-6]。与动植物源脂肪酶相比，微生物产生的脂肪酶成本较低、更易分离纯化、生产较为方便等，因而更具有研究价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。本试验土样取自山东第一医科大学后厨以及泰安油坊富含油脂的土壤，将采集的样品装入样品袋中保存并做好标签。

1.1.2 培养基与试剂。富集培养基[7]成分为：酵母浸粉0.2g/L、NaCl 0.5 g/L、Na2HPO43.5 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

筛选培养基[7]：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L，pH值7.2～7.4。固体培养基加入1.5%琼脂，在121℃条件下灭菌20 min。初筛培养基中加入罗丹明B 10 mL/L、橄榄油乳化液12 mL/L。复筛培养基中加入橄榄油乳化液12 mL/L。

发酵培养基[7]：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.1 g/L、橄榄油乳化液12 mL/L，pH值6。

种子培养基[8]：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨25 g/L、K2HPO45 g/L、（NH4）2SO45 g/L、MgSO40.5 g/L、橄榄油乳化液10 mL/L。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的富集培养。取10 g土样溶于90 mL无菌水中制成土壤悬液[9]，以1%接种量接入富集培养基中，28℃、200 r/min摇床培养24 h。连续重复培养3 代。 富集培养液按稀释倍数为 10-4、10-5、10-6、10-7进行浓度梯度稀释，取0.1 mL均匀涂布在筛选培养基上，于 28 ℃倒置培养 2～4 d[7，10]。

1.2.2 目标菌株筛选。选取在360 nm紫外光下菌落周围荧光圈较大的单菌落[11]，并对其划线分离，直到平板中只存在一种菌落。将分离纯化的菌株接入斜面培养基中，保存于含甘油30%的管中，放入4℃冰箱中保存。

1.2.3 菌种鉴定。将脂肪酶含量最高的菌株Youzh-1送去北京睿博兴生物技术有限科公司进行16S rRNA测序分析，并进行同源性对比分析，利用MEGA 5.0构建系统发育进化树。

1.2.4 酶活测定方法。参照文献[12-13]进行脂肪酶活力测定，并略作修改。

1.3 发酵条件优化

1.3.1 单因素试验。通过单因素试验考察培养基中碳源（葡萄糖、NaHCO3、蛋白胨、蔗糖、乳糖）、氮源（硫酸铵、硝酸钠、尿素、酵母膏、牛肉膏）、温度（28、30、34、37、40 ℃）、pH 值（5、6、7、8、9）对脂肪酶活性的影响，以确定最适产酶条件。

1.3.2 响应面法优化试验。在单因素试验的基础上，选取4个相关影响因素，并以酶活力作为因变量，利用Design Expert 11.0软件设计Box-Behnken试验（4因素3水平），以探究高产脂肪酶菌株的最佳发酵工艺和参数组合并进行验证试验。试验因素和水平如表1所示。

表1 Box-Behnken试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 高产酶菌株的筛选

从土壤中得到多种菌株，在经过平板初筛及酶活测定复筛之后从中选出具有高产脂肪酶性质的菌株。得到的一株高产脂肪酶菌株为Youzh-1，脂肪酶活力为37.67 U/mL。

2.2 菌种鉴定

选脂肪酶活力最高的菌株Youzh-1经16S rRNA测序分析后，再通过NCBI中的BLAST同源性对比分析，发现在Genbank数据库中，Youzh-1与Pseudomonas fluorescens菌株ORTB3的16S rRNA同源性为100%。利用软件MEGA 5.0构建邻接系统进化树，Youzh-1与荧光假单胞菌亲缘关系最近，可以确定Youzh-1为荧光假单胞菌属（图1）。

2.3 单因素试验优化发酵条件

2.3.1 碳源种类以及碳源添加量对脂肪酶活力的影响。由图2和图3可知，在以碳源为葡萄糖时脂肪酶的活力最高，碳源为NaHCO3时脂肪酶活力最低，故最适碳源为葡萄糖。当葡萄糖添加量为5～15 g/L时，脂肪酶活力不断增大并在葡萄糖添加量为15 g/L时达到最大；当葡萄糖添加量为15～25 g/L时，脂肪酶活力不断降低。因此，最适葡萄糖添加量为15 g/L。

2.3.2 温度对脂肪酶活力的影响。从图4可以看出，当菌株Youzh-1发酵温度在28～31℃时，脂肪酶活力突然增大；在31～37℃时脂肪酶活力呈不稳定上升趋势，并在37℃时达到最大；在37～40℃酶活迅速下降。因此，对于Youzh-1菌株来说，菌株最适发酵温度为37℃。

2.3.3 pH值对脂肪酶活力的影响。从图5可以看出，菌株Youzh-1产生的脂肪酶活力在pH值5～6范围内不断上升，并在pH值为6时达到最大值，在pH值6～9范围内迅速下降，可见pH值对于脂肪酶活力的影响较大。

2.3.4 氮源种类以及氮源添加量对脂肪酶活力的影响。由图6和图7可知，当氮源为牛肉膏时，脂肪酶的活力最高，当氮源为尿素时，脂肪酶活力最低，故最适氮源为牛肉膏。当牛肉膏添加量为5～15 g/L时，脂肪酶活力变化不明显；牛肉膏添加量为15～20 g/L时，脂肪酶活力急剧升高并在20 g/L时达到最高；当牛肉膏添加量大于20 g/L时脂肪酶活力下降。由此可以看出，牛肉膏添加量为20 g/L时对菌株Youzh-1发酵产脂肪酶最有利。

2.4 响应面法优化发酵条件

2.4.1 Box-Behnken试验设计及结果分析。利用Design Expert 11.0软件设计Box-Behnken试验各因素的响应结果如表2所示。

表2 响应面法优化高产脂肪酶菌株发酵工艺试验结果

利用Design Expert 11.0对表2的试验结果进行分析，得到以酶活大小作为响应值的回归方程为：Y=85.06+6.70A+7.40B+2.97C+0.6337D-6.40AB-1.97AC-1.53AD+0.3025BC+1.01BD-3.09CD-8.91A2-0.67B2-11.87C2-10.45D2。

2.4.2 回归模型方差分析。对回归模型进行方差分析，如表3所示。模型的P值＜0.000 1，表明本试验选用的二次多项模型极显著；失拟项P=0.301 3＞0.05，不显著，表明模型与试验数据拟合度好，误差小；相关系数R2=0.932 6，表明了试验值与预测值的拟合性较好，能够较真实地模拟曲面；模型的校正决定系数R2Adj=0.865 2，表明该模型可以解释86.52%的变化。从方差分析结果可以看出，4个因素对脂肪酶活性的影响作用从大到小依次为B＞A＞C＞D。

表3 高产脂肪酶菌株发酵条件回归模型方差分析

2.4.3 发酵条件各因素相互作用分析。从图8可以看出，随着葡萄糖和牛肉膏的增加脂肪酶活力呈先增大后减少的趋势，而且从其等高线图中可以看出，葡萄糖添加量一侧的等高线较陡，说明葡萄糖添加量对脂肪酶活力影响较牛肉膏添加量对脂肪酶活力的影响更明显；随着葡萄糖添加量和温度增加脂肪酶活力呈先增大后减少的趋势，而且从其等高线图中可以看出，葡萄糖添加量一侧的等高线较陡，说明葡萄糖添加量对脂肪酶活力影响较温度对脂肪酶活力的影响更明显；随着牛肉膏添加量和温度增加，脂肪酶活力呈先增大后减小的趋势，而在其等高线图中可以看出，牛肉膏添加量与温度的等高线图近似于圆形，说明牛肉膏添加量与温度对于脂肪酶活力的交互作用不太明显；随着牛肉膏添加量和pH值的增加，脂肪酶活力呈先增大后减小的趋势，从其等高线图中可以看出，二者的等高线图近似于圆形，说明二者对于脂肪酶活力的交互作用不明显；随着葡萄糖添加量和pH值增加，脂肪酶活力呈先增大后减少的趋势，而且从其等高线图可以看出，葡萄糖添加量一侧的等高线较陡，说明葡萄糖添加量对脂肪酶活力影响较pH值对脂肪酶活力的影响更明显；随着温度和pH值的增加，脂肪酶活力呈先增大后减小的趋势，而且从其等高线图可以看出，pH值一侧的等高线相对于温度一侧较为密集，说明pH值较温度对脂肪酶活力的影响明显。

2.4.4 发酵条件响应面优化验证试验结果。在模型预测的培养基最优配比条件下进行发酵试验，预测的脂肪酶活力理论最大值达到87.19 U/mL。通过响应面法得到优化后的发酵条件为葡萄糖添加量18.825 g/L、牛肉膏添加量25.98 g/L、温度41℃、pH值6，在此条件下进行发酵试验验证，测定脂肪酶活力为79.87 U/mL，较模型预测理论值87.19 U/mL减少了8.39%，证明模型可靠。

3 结论与讨论

脂肪酶作为生产生活中重要的酶之一，现已有越来越多的研究者对其进行多方面的研究。将菌株用于工业生产，都必须先对其发酵条件进行优化[14]。因此，在工业上通过优化发酵工艺提高酶产量来压缩生产成本有着重要意义[15]。

本文在单因素试验的基础上采用响应面法对荧光假单胞菌的发酵条件进行进一步优化设计，得到最佳发酵工艺为葡萄糖添加量18.825 g/L、牛肉膏添加量25.98 g/L、温度41℃、pH值6，在此条件下测得脂肪酶活力为79.87 U/mL，较理论值87.19 U/mL减少了8.39%，证明模型可靠。微生物来源的脂肪酶具有易生产、易于分离纯化、产量高等特点，可以在工业生产中利用微生物发酵生产脂肪酶，下一步可就菌株遗传改良进行研究，以提高脂肪酶活力。