甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立

吴伟怀，刘宝慧，鹿鹏鹏，梁艳琼，贺春萍，李锐，易克贤

（1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海口 571101；2.南京农业大学植物保护学院，南京 210095；3.海南大学植物保护学院，海口 570228）

0 引言

由黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephalaSydow）引起的甘蔗褐锈病是甘蔗生产中较为严重的病害之一[1]。该病主要为害叶片，起初病斑为淡黄色小斑点，并伴有黄色晕圈，后期病斑扩大，颜色变为深褐色。夏孢子堆为红褐色，大多数着生在叶背面，严重时，叶正面也可见红褐色孢子堆。受害后的甘蔗分蘖减少，蔗茎变细[2]。在我国，甘蔗锈病在云南、四川、江西、福建和广东等甘蔗产区发生，一般减产15%～30%，严重时可达40%以上，使得蔗糖含量下降10%～36%[3]。过去，该病害的鉴定主要依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。该方法需经过病原菌的分离（获得）—形态鉴定—回接与再分离等过程，整个过程费时费力，还需要具备专业的分类学知识以及丰富的经验。即使如此，其结果的准确性和可信度易受外界因素的影响，难以满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。显然，依靠上述方法是无法对甘蔗褐锈病早期发生情况进行快速准确鉴定。所以有必要对甘蔗褐锈病菌的检测与监测技术做进一步的研究。

由巢式PCR（Nested PCR）基础上改进而来的单管巢式PCR（Single-tube nested PCR），其具体原理是在同一个PCR 管中加入两对引物（外引物、内引物对）以完成两轮PCR 扩增；扩增所需反应液组分与普通PCR 的一样，只是在扩增时外引物的退火温度要高于内引物对的退火温度约10 ℃。这样在第一轮外引物扩增时，而此温度下内引物不能结合；随后第二轮内引物扩增以第一轮扩增反应产物为模板，内引物在较低退火温度扩增时，此时外引物则因消耗完（控制外引物量）而不能进行有效扩增[4]。与巢氏PCR相比，单管巢氏PCR由于试验过程中不需要开PCR 管操作，从而降低了污染的风险[4]。目前该技术已在梨火疫病病原菌（Erwinia amylovora）[5]、母羊胎儿组织弓形虫（Toxoplasma gondii）[6]、猫屎胎三毛滴虫（Tritrichomonas foetus）[7]、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）[8]、谷物样品镰刀病菌（Fusarium culmorum）[9]、菠萝凋萎病（Pineapple mealybug wilt）[10]、内脏利什曼病（Visceral leishmaniasis）[11]、浓毒症（Pythiosis）[12]、结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis）[13]、人类疟原虫（Human plasmodium）[14]等病原物检测中得以应用。目前，针对甘蔗褐锈菌虽已建立了该病原菌的常规PCR[15-16]以及巢式PCR分子检测方法[17]，但是关于该病原菌的单管巢式PCR的检测体系尚未建立。为此，本文拟建立甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系，为该病原菌的鉴定与检测提供一种可靠的分子诊断技术。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究供试样品DNA 共计16份，分别为甘蔗褐锈病菌（P.melanocephala）、甘蔗黄锈病菌（P.kuehnii）、咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）、橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、咖啡褐斑病菌（Cercospora coffeicola）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）各2 份，以及甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）、剑麻茎腐病菌（Aspergillus niger）、鸡蛋花鞘锈菌（Coleosporium plumierae）、葡萄层锈病菌（Phakopsora ampelopsidis）各1份（表1）。

表1 供试菌株Table 1 Strains used in this study

其中甘蔗褐锈病菌Pm1与Pm2，经提取核酸后检测与克隆测序确认为甘蔗褐锈病菌后，作为本试验的阳性样品；而来自甘蔗褐锈病菌Pm1 菌株的ITS 质粒DNA 则作为灵敏度分析的DNA 模板；而其余甘蔗黄锈病菌、鸡蛋花鞘锈菌、橡胶炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌、剑麻茎腐病菌、甘蔗黑穗病菌样品、葡萄层锈病菌等DNA 样品一起作为特异性分析模板。所有菌株DNA 样品均保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因组总DNA提取

甘蔗褐锈病菌DNA 的提取方法采用CTAB法提取[18]；其他供试菌株的DNA 提取均采用真菌DNA 提取试剂盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美国）提取，具体实验步骤按试剂盒的参考说明书进行。

1.2.2 甘蔗褐锈病菌ITS重组质粒的构建

利用WHITE等设计的引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[19]对甘蔗褐锈病菌基因组DNA 进行扩增。反应体系为20 μL∶dd H2O 14.3 μL，10×rTaqBuffer 2 μL，2.5 mmol/L d NTPs 1.6 μL，rTaqDNA Polymerase 0.1 μL，10 μmol/L 的上下引物各0.5 μL，30 ng/μL 模板DNA 1 μL。PCR扩增程序为：94 ℃下预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环后72 ℃延伸4 min，结束后保存于12 ℃。将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。取2 μL PCR 回收产物与pEASY-T1连接，并转化到大肠杆菌培养（E.colitrans T1），经菌落PCR鉴定为阳性克隆后，用OMEGA 质粒提取试剂盒提取构建的重组质粒DNA，委托英潍捷基（上海）贸易有限公司广州实验室进行测序。

1.2.3 引物设计

通过下载与甘蔗褐锈病菌ITS 序列同源性比较高的相关序列，比对获得甘蔗褐锈病菌ITS 序列的保守区域。基于单管巢式PCR 扩增引物设计原理：一般外引物退火温度高于内引物10 ℃左右，以所获得Pm1 菌株ITS 序列为参考，利用Primer explorer 5.0 在线软件针对多态性丰富特异性区域设计引物，设计好的引物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司广州合成部合成。

1.2.4 外引物与内引物最佳退火温度筛选

为了确认甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 最佳的退火温度，对所设计的内引物进行52～66 ℃梯度退火温度扩增，筛选出最佳退火温度；在内引物最佳退火温度的基础上，对外引物设置61～73 ℃梯度退火温度，从中筛选出高于内引物最佳退火温度大约10 ℃的外引物最佳退火温度。

上述扩增均采用20 μL 反应体系，其具体程序与参数同1.2.2。内引物的反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，梯度退火温度52～66 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35个循环，72 ℃延伸4 min，12 ℃保存。外引物的反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，梯度退火温度61～73 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35 个循环，72 ℃延伸4 min，12℃保存。

1.2.5 外引物与内引物最佳浓度比筛选

单管巢式PCR 正常运转的第二个条件即为：通过外引物与内引物量的不同而到达控制外引物扩增。具体而言，在第一轮扩增中（外引物扩增）引物消耗殆尽后，内引物则以外引物产生的模板进行第二轮扩增。为此，以筛选出的外、内最佳退火温度为基础，设置外引物为1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6个不同的浓度，内引物设置为10 μmol/L，交叉组合进行单管巢式PCR浓度比试验。

1.2.6 特异性分析及验证

选取甘蔗褐锈病菌、甘蔗黄锈病菌、咖啡驼孢锈菌、橡胶炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌菌株各2 株，以及鸡蛋花鞘锈菌、葡萄层锈菌、甘蔗黑穗病菌、剑麻茎腐病菌株各1株，以上述16份菌株DNA为模板，并以dd H2O 为阴性对照。对所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测体系进行特异性分析。PCR 反应体系以及反应程序以1.2.4和1.2.5最终确定的条件为准。

选用EcoRI酶对PCR产物进行酶切验证。酶切体系（20 μL）：10×Quick CutBuffer2 μL、PCR产物8 μL、EcoRI 1.5 μL、dd H2O 8.5 μL。酶切程序：37 ℃3 h 30 min，65 ℃30 min。酶切产物用2%的琼脂凝胶电泳检测。

1.2.7 灵敏度分析

利用超微量分光光度计（NanoDrop 2000c）将质粒DNA 初始浓度调整为10 ng/μL，采用梯度稀释法对DNA 进行100～10-6倍的稀释，以dd H2O 为阴性对照，进行PCR 检测。采用优化后的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测体系，进行灵敏度分析。并利用PmF2/R2 进行普通PCR 灵敏度检测，反应体系及反应程序参考1.2.4和1.2.5。

1.2.8 田间疑似病样采集与DNA提取

从广东湛江农垦东方红农场甘蔗地收集疑似甘蔗褐锈病病叶，采用CTAB 法提取叶片总DNA，以进行单管巢式PCR检测鉴定。

2 结果与分析

2.1 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR的引物设计

将甘蔗褐锈病菌ITS 序列与下载自NCBI 数据库中包括锈菌目10 个科14 个属的24 条同源序列通过DNAStar 软件以及在MultAlin 网站上（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin.html）进行多重比对。结果表明，甘蔗褐锈病菌ITS 序列与其它菌株序列存在差异区域，最终根据差异区域设计了外引物对PmF1/R1 与内引物对PmF2/R2，二者预期扩增片段大小分别为433 bp、266 bp（表2）。

表2 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 引物Table 2 Single-tube nested PCR primers for P.melanocephala

2.2 内引物与外引物的最佳退火温度

根据已合成引物的预期退火温度，将内引物对PmF2/R2设置为52～66 ℃8 个梯度退火温度进行PCR 扩增。结果表明，在供试的8 个退火温度中，内引物PmF2/R2 在退火温度为52～57.3 ℃时，均能扩增出特异目的条带；退火温度为60.5 ℃时未扩增出特异性目的条带。因此，内引物的最高退火温度为57.3 ℃。据此，选取52 ℃作为内引物的最佳退火温度，开展后续试验（图1）。

图1 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR内引物最佳退火温度优化Fig.1 Optimization of annealing temperature for internal single-tube nested primers for P.melanocephala

同理，根据已合成引物的预期退火温度，将外引物设置为61～73 ℃8 个梯度退火温度进行PCR 扩增，结果发现只有退火温度为61～63.4 ℃时能扩增出清晰且特异条带，退火温度为65.5 ℃时，所扩增出的条带较微弱，而其余4 个退火温度均未出现目的条带（图2）。而内引物在退火温度60.5 ℃及其以上时，并不能有效扩增。换言之，只有外引物退火温度为60.5 ℃及以上时，方可到达单管巢式PCR 中外引物有效扩增。当退火温度为63.4 ℃，条带最为清晰，所以，选取63 ℃作为外引物的最佳退火温度。

图2 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR外引物最佳退火温度优化Fig.2 Annealing temperature of single-tube nested PCR outer-primers for P.melanocephala

2.3 单管巢式PCR检测体系外、内引物最佳浓度比

通过设置外引物为1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6个浓度梯度，将内引物浓度设为10 μmol/L，筛选可进行单管巢式PCR 外引物的有效量。试验结果表明，供试的6 个不同外内引物浓度比中，均能扩增出相应的目的条带（图3）。从清晰度角度考虑，当引物浓度为10 pmol/L 时，肉眼可见条带最为清晰明亮，所以将外引物的最佳浓度定位10 pmol/L。因此，外内引物的最佳终浓度比为0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。

图3 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR外内引物最佳浓度筛选Fig.3 Screening of optimal concentration of outer and inner primers for single tube nested PCR for P.melanocephala

2.4 单管巢式PCR检测体系特异性分析

利用所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测体系，对2份甘蔗褐锈病菌，以及14份其它非甘蔗褐锈病菌株DNA 进行扩增，并对PCR 产物进行酶切验证其真实性。试验结果表明，只有DNA 模板为甘蔗褐锈病菌时，可产生肉眼可见的清晰且特异的目的条带，而其它14 株非甘蔗褐锈病菌DNA 均未扩增出目的条带（图4）。同时，扩增出的甘蔗褐锈病菌PCR 产物进行EcoRI酶切验证，其酶切产物电泳出112 bp清晰条带（图5）。由此表明，所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系具有高度的特异性。

图4 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR特异性分析Fig.4 Specificity analysis of single-tube nested PCR for P.melanocephala

图5 甘蔗褐锈病菌PCR产物酶切Fig.5 PCR product digestion of P.melanocephala

2.5 灵敏度效果分析

单管巢式PCR 灵敏度结果显示，在供试的8 个模板浓度中，前7 个模板的扩增条带强弱随其浓度的降低而依次变弱。当质粒模板浓度为10 fg/μL时，检测出的目的条带最弱；而当质粒模板浓度大于10 fg/μL时，则检测不出目的条带。由此表明，所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测体系的最低检测浓度为10 fg/μL（图6A）。比较而言，普通PCR 的最低检测浓度为10 pg/μL（图6B）。所以，本试验所开发的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR反应体系的最低检测终浓度（10 fg/μL）是常规PCR最低检测终浓度（10 pg/μL）的1 000倍。

图6 甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR灵敏度检测Fig.6 Sensitivity detection of single-tube nested for P.melanocephala

2.6 田间疑似病样分子鉴定

对田间采集的19 份疑似病样进行了单管巢式PCR 检测，检测结果表明，其中18 份样品经检测均扩增出唯一条带，其大小与预期的266 bp 一致。利用EcoRI 酶对18 份样品PCR 产物进行酶切，酶切结果表明，所有样品PCR 产物均可酶切出预期大小的目的条带。总之，采集的19份疑似病样经单管巢式PCR 检测后，其中18份样品DNA 中均含有甘蔗褐锈病菌（表3）。

表3 田间疑似病样的分子检测Table 3 Molecular detection of suspected disease samples in the field

3 讨论与结论

随着分子生物技术的不断发展，许多技术用于病原微生物的分子检测中。巢式PCR 检测技术由于通过两轮PCR 的扩增而大大提高了检测的灵敏性，也正是通过第一轮扩增而产生的非特异性序列，由于不包含第二轮引物的扩增位点以致于其特异性也大大提高[4]。正因为巢式PCR 具有较好的特异性与灵敏度，已被广泛应用。然而，巢式PCR 在以第一轮PCR产物作为模板扩增过程中其被潜在污染的风险也随之增加。为此，基于巢式PCR改善而来的单管巢式PCR能很好地克服该缺点。

分子检测技术得以广泛应用的前提条件就是高质量的引物。换言之，开发出高度特异引物对是分子检测技术赖以生存的首要条件[20-21]。为此，在本研究中通过对锈菌目10 个科14个属的24 条ITS 序列进行比对分析，发现甘蔗褐锈病菌ITS区域与其它非甘蔗褐锈病菌存在一段特异区域。基于该特异性区域，结合单管巢式PCR 引物设计原则中外引物对与内引物对退火温度的要求，最终设计了单管巢式PCR 嵌套式引物对PmF1/R1与PmF2/R2，二者退火温度预期相差约15 ℃。这为甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测技术的建立奠定了基础。

单管巢式PCR 检测技术得以运行的关键因素之一，即外引物的退火温度必须高于内引物的退火温度10 ℃以上[10]。为此，本试验对设计的2对引物外引物与内引物的实际退火温度进行了筛选。根据试验结果，最终筛选出甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR分子检测技术的外引物与内引物的退火温度分别为63 ℃与52 ℃。

在单管巢式PCR 检测中，外引物与内引物量的比例是建立该检测体系的又一关键因素[4]。为此，本研究对外引物对PmF1/R1 与内引物PmF2/R2 对之间的比例进行了筛选与优化。经试验结果表明甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测技术外引物与内引物的最佳比例为0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。尽管单管巢式PCR 检测技术体系中外引物与内引物的比例是十分关键的，但是针对不同引物其最佳引物比例也是不同的。如母羊胎儿组织勾形虫外内引物终浓度比例为0.01 μmol/L∶0.4 μmol/L[6]，谷物样品镰刀病菌外内引物终浓度比0.1 fmol/L∶1 pmol/L[9]，菠萝凋萎病外内引物浓度比为2 pmol/L∶0.2 nmol/L[10]，猫屎胎三毛滴虫外内引物浓度比为12.5 fmol/L∶0.25 pmol/L[7]。总而言之，单管巢式PCR 检测技术体系中外引物与内引物的比例是十分关键的，但针对不同引物，其最佳比例也不同。

本研究先后对建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测体系的特异性、灵敏度等方面进行了测定。特异性结果显示：该检测体系只能从含有甘蔗褐锈病菌的DNA 模板中检测出目的条带，其它非同属不同种的模板DNA 没有产生任何条带，具有高度的特异性。灵敏度结果显示，甘蔗褐锈病菌单管巢式的灵敏度可达10 fg/μL。这一结果与结核性脑膜炎单管巢氏的灵敏度（1 fg/μL）[13]、霍乱弧菌的灵敏度（1 fg/μL）[8]相当，但是要比菠萝凋萎病菌单管巢氏的灵敏度（0.95 pg/μL）[10]、脓毒症病原菌（Pythium insidiosum）单管巢氏的灵敏度（2.7 pg/μL）[12]均要灵敏。最后利用该检测技术，对19 份疑似病样进行了检测，其中18份样本DNA 中均检测出甘蔗褐锈病菌。由此可见，本研究所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR 检测体系具有高度的特异性、灵敏性以及实用性。