马达加斯加龙树实时荧光定量PCR鉴定方法的研究

李井干 吴晶 伏建国 杨晓军 张明哲

摘要 [目的]通过设计特异性引物与荧光探针，建立马达加斯加龙树（Didierea madagascariensis）实时荧光定量PCR鉴定方法。[方法]提取26份龙树科植物基因组，并用内源基因检测DNA质量;根据GenBank中已发表的马达加斯加龙树的PEPC基因序列，设计特异性引物与荧光探针，通过检测26份供试样本，检测该方法的特异性;将样品DNA进行10倍梯度稀释，以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。[结果]只有3份马达加斯加龙树样本出现典型的扩增曲线，其他23份龙树科植物无典型的扩增曲线;核酸原液与10-1～10-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线，标准曲线的决定系数（R2）为0.995，检测限量为5.2×10-3 ng/μL。[结论]该方法特异性强、灵敏度高，可有效地应用于马达加斯加龙树的鉴定。

关键词 马达加斯加龙树;实时荧光定量PCR;鉴定

中图分类号 Q 943  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0168-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on Identification of Didierea madagascariensis with Real-time PCR Method

LI Jing-gan，WU Jing，FU Jian-guo et al

（Animal，Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract [Objective]A real-time fluorescent quantitative PCR detection method for Didierea madagascariensis was established by designing specific primers and fluorescent probes.[Method]26 samples of didiereaceae plants were extracted，and DNA quality was detected with endogenous genes.Specific primers and probe were designed according to the published PEPC genes of Didierea madagascariensis and were used to detecting 26 testing samples，the specificity and sensitivity were detected by screening 26 testing samples.The sample DNA was serially diluted 10 times to test the sensitivity of real-time PCR method.[Result]Typical amplification curves could be obtained for 3 Didierea madagascariensis samples，but not for other 23 samples.The nucleic acid stoste and its diluents from 10-1-10-4 times could also be deteced the signals，the determination coefficient （R2）of the standard curve was 0.995 and the detection limit was 5.2×10-3 ng/μL.[Conclusion]The method has strong specificity and high sensitivity，and can be effectively applied to the identification of Didierea madagascariensis.

Key words Didierea madagascariensis;Real-time PCR;Identification

马达加斯加龙树（Didierea madagascariensis）属龙树科（Didiereaceae）刺棘木属（Didierea）[1]，马达加斯加特有种，因当地人类生活、农业生产、养牛场建设而变得濒危[2]，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ。龙树科叶形多变，线形、梭形、卵形和心形都有，叶常在旱季脱落[3]。目前马达加斯加龙树的鉴定主要以形态学为主，且叶片是鉴定马达加斯加龙树的重要依据，马达加斯加龙树的叶脱落后，会给马达加斯加龙树的鉴定带来一定难度，因此需要制定分子生物学的鉴定方法，用于快速准确鉴定马达加斯加龙树，为口岸进境物种的鉴定研究奠定基础，并有助于濒危物种的保护。

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[4]。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特異性强、重复性好及高通量等特点[5]，目前该技术已被广泛应用于遗传学、育种学、营养学和医学等研究领域[6-7]，但该方法在濒危物种的鉴定方面应用较少。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）基因在龙树科植物内广泛存在[8]，根据马达加斯加龙树PEPC序列特有的保守突变位点，设计用于实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探针，研究马达加斯加龙树的分子鉴定方法，并检测该方法的实用性，为濒危物种的鉴定提供新的方法和思路。4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4

1 材料与方法

1.1 试验材料 所用26份试验材料来自江苏南京和福建厦门，均由相关专家鉴定，采集新鲜植株叶片进行试验。样品的详细信息见表1。

1.2 基因组DNA提取

先将供试植物叶片进行表面消毒，用液氮研磨成粉，参照DNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书上的步骤方法，提取试验样品基因组DNA。用超微量分光光度计One drop OD2000+测定提取样品DNA浓度。

1.3 引物与探针设计

通过BioEdit软件对马达加斯加龙树的PEPC基因序列与龙树科其他植物PEPC基因序列进行多重序列比对，找出马达加斯加龙树的特异性位点突变区，应用引物和探针设计软件Primer Express设计实时荧光定量PCR引物和探针。探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团BHQ1。内源基因参照SN/T 1204—2016中18S rRNA序列[9]。具体序列见表2。

1.4 内源基因检测

应用通用植物内源基因18S rRNA对提取样品基因组DNA进行实时荧光定量PCR检测，检测待测样品是否有典型扩增曲线。如未出现实时荧光定量PCR扩增曲线，则说明提取的样品DNA质量有问题，或DNA提取液中有抑制物质，应重新提取或纯化待测样品基因组DNA，直到扩增出典型扩增曲线。

1.5 实时荧光PCR扩增

试验所用TaKaRa Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）购自南京易特派仪器仪表有限公司，核酸提取试剂盒DNeasy Plant Mini kit购自凯杰公司，实时荧光PCR仪为ABI 7500 FAST荧光定量PCR仪。

实时荧光定量PCR反应体系：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10.0 μL，上游引物 （10 μmol/L ） 0.8 μL，下游引物 （10 μmol/L） 0.8 μL，探针（10 μmol/L） 0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，补水至20 μL。实时荧光定量PCR反应程序：94 ℃，15 s;64 ℃，1 min。

1.6 特异性试验 将所有样品放入实时荧光定量PCR仪，按照设定反应条件进行扩增，观察反应体系的特异性。

1.7 灵敏性试验 取马达加斯加龙树叶片提取的基因组DNA，以超微量分光光度计测定核酸浓度，对DNA进行10倍梯度系列稀释，取各浓度DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，每个浓度做3个重复。

2 结果与分析

2.1 内源基因检测

用通用植物内源基因18S rRNA对26份提取基因组DNA进行实时荧光定量PCR检测，结果显示所有待测样品均有典型的扩增曲线，其循环阈值（Ct）在12～20。按照标准SN/T 1204—2016，内源基因检测Ct值需要小于或等于30。内源基因检测结果表明，所提样品DNA均没有问题，可以进行后续灵敏度和特异性试验。具体结果见图1。

2.2 实时荧光定量PCR特异性检测

应用设计的特异性引物和荧光探针，对26份样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，结果显示只有3份马达加斯加龙树样品出现典型的扩增曲线（图2）。表明所设计的引物和荧光探针对马达加斯加龙树具有良好的特异性。

2.3 实时荧光定量PCR检测灵敏度

提取马达加斯加龙树样品D17基因组DNA后，测定核酸浓度为52.3 ng/μL。将该样品DNA进行 10倍梯度稀释，以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。扩增结果显示，核酸原液与10-1～10-4倍稀释液样本均能够得到典型的扩增曲线，根据阴性对照设置阈值线，得到其Ct值分别为23.564、26.522、29.668、33.857、36.646;10-5、10-6和10-7 DNA稀释液样本未得到典型的扩增曲线，判定为阴性。该灵敏度试验的标准曲线的决定系数（R2）为0.995（图3），检测限量为5.2×10-3 ng/μL。

3 讨论与结论

CITES的精神在于管制而非完全禁止野生物种的国际贸易，其用物种分级与许可证的方式，以达成野生物种市场的永续利用性，我国于1980年12月25日加入该公约。马达加斯加龙树被列入CITES附录Ⅱ中，属于被管制的国际贸易对象。为更好履行CITES公约责任，提高外来物种的快速准确检测能力，建立马达加斯加龙树的实时荧光定量PCR鉴定方法，不仅对马达加斯加龙树的保护具有重要意义，也有助于提升濒危物种的鉴定水平。

PEPC是C4植物[10]和CAM植物[11]光合作用的关键酶之一，在种子萌发和形成[12]、调节保卫细胞[13]、促进苹果酸的合成[14]、植物抗生物和非生物胁迫[15]中有重要作用。PEPC基因具有高度的保守性[16]，已用于铁皮石斛[17]和菌草[18]的遗传多样性分析，表明PEPC基因可以作为物种鉴定的候选片段。

该研究根据马达加斯加龙树与其他龙树科物种PEPC序列差异，设计开发了马达加斯加龙树的特异性引物探针，该引物可以将马达加斯加龙树从刺棘木科植物中区分开来，表现出了良好的特异性。该方法检测限量为5.2×10-3 ng/μL，具有良好的灵敏度，提取的樣品DNA完全能够满足检测鉴定需要。该方法的建立将有助于植物物种的准确鉴定工作的开展，对濒危物种的保护具有重要意义，也为我国CITES履约、海关执法等提供更加科学准确的技术依据。

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