猪流行性腹泻疫苗不同免疫程序的效果评估

齐海涛 ， 王 利 ， 杨学刚 ， 杨耀智 ， 郭 鑫

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 黑龙江大北农农牧食品有限公司 ， 黑龙江 哈尔滨 150021 ； 3. 新希望六和股份有限公司 ， 北京 海淀 100102)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarthea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarthea virus,PEDV)引起的病毒性传染病，以引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水为主要特征，7日龄内仔猪表现高死亡率。20世纪90年代以来，我国开发了以CV777毒株为原型的灭活疫苗，其广泛使用控制了PED的大规模流行，使该病呈零星暴发和区域性感染。直到2010年10月，我国南部省份暴发PED，Wang等[1]首次报道了PEDV的新变异株，自此之后在全国各个省份都有流行，仔猪感染PEDV死亡率高达80%以上，给养殖业造成巨大的经济损失。2018—2019年对我国广东省的8个养猪场进行采样检测肠道病原体，PEDV的检出率为47.0%(16/34)[2]。在此次调查中研究人员还发现，广东流行的PEDV毒株存在S基因的重组，因此迫切需要开发新疫苗以应对新的PEDV变异毒株。

关于PED疫苗免疫有效性的说法众说纷纭,对疫苗免疫后效果的评估较少。目前控制仔猪PED尚无有效治疗药物，选择合适的疫苗及合理的免疫程序是预防PED的重要措施。有研究表明，猪流行性腹泻的免疫主要依靠黏膜免疫，高水平的分泌型母源IgA抗体与仔猪抵抗PEDV感染呈正相关，而与血液中的IgG抗体相关性较低[3]。朱海侠等[4]研究表明，乳汁中PEDV IgA抗体与血清IgA抗体呈现很好的相关性，且乳汁中 IgA抗体水平远远高于血清。因此，如何刺激动物机体产生高水平的分泌型IgA抗体，是PED疫苗免疫以及PED防控的关键。本试验通过对比不同类型疫苗以不同时间、不同组合接种妊娠母猪，评估疫苗免疫对母猪初乳中IgA抗体含量及持续时间的影响，以期为规模化猪场新生仔猪PED的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(简称猪腹泻二联活苗)，购自福州大北农生物技术有限公司，生产批号：130141109；猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(简称猪腹泻二联灭活苗)，购自武汉科前生物股份有限公司，生产批号：170041124；猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒，购自美国爱德士公司，生产批号：56D230。

1.2 主要仪器设备 酶标仪、恒温培养箱、多道移液器、台式高速冷冻型微量离心机、医用冷藏柜HYC-650等。

1.3 实验动物 大北农集团唐山种猪场健康妊娠母猪，经检测PEDV抗原、抗体均为阴性。

1.4 试验设计

1.4.1 PED疫苗不同组合免疫效果评估 2017年9月—2018年9月，选取PEDV抗原、抗体阴性健康妊娠母猪125头，平均分成5个组，每组25头。第1组：2次猪腹泻二联灭活苗免疫(产前40 d、20 d)；第2组：2次猪腹泻二联活苗免疫(产前40 d、20 d)；第3组：1次猪腹泻二联活苗免疫(产前40 d)+1次猪腹泻二联灭活苗免疫(产前20 d)；第4组：2次猪腹泻二联活苗免疫(产前60 d、40 d)+1次猪腹泻二联灭活苗免疫(产前20 d)；对照组：2次疫苗稀释液免疫注射(产前40 d、20 d)。试验疫苗用法与用量：猪腹泻二联灭活疫苗，妊娠母猪后海穴注射，每次4 mL;猪腹泻二联活苗，妊娠母猪后海穴注射，每次1头份；对照组妊娠母猪后海穴注射4 mL 疫苗稀释液。母猪产仔当天收集乳汁2 mL，用ELISA方法检测初乳中IgA抗体值。

1.4.2 免疫后乳汁中PEDV的IgA抗体持续时间测定 对第2组和第4组的母猪随机选取10头，分别在产后3、6、9、12 d和15 d收集乳汁，检测乳汁中IgA抗体，评估IgA抗体持续时间。

1.4.3 乳汁中PEDV的IgA抗体测定与计算 按照抗体检测试剂盒说明书对所有试验母猪初乳中PEDV IgA抗体进行检测。(1) 检测的有效性：①阴性对照OD650 nm(NC)平均值<0.200；②阳性对照OD650 nm(PC)平均值>0.500，上述任何一个值超出规定的范围，则该试验被视为无效，所检的样品需要重新进行检测；(2)计算：按照猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒说明书计算样品与阳性对照(S/P)的比值。结果判定：阴性S/P<0.50；阳性S/P≥0.50。

2 结果

2.1 PED疫苗不同组合免疫后乳汁中IgA抗体检测 结果如表1所示，4个免疫组中第2组和第4组的免疫组合效果较好，抗体阳性率分别为93.75%和97.50%，阳性平均OD值分别为1.535和1.447，免疫后诱导机体产生的IgA抗体整齐度好；第1组IgA抗体阳性率最差，为38.13%；第3组IgA抗体阳性率为80%，免疫效果居中。

表1 不同免疫程序的IgA抗体阳性率与平均OD值

2.2 免疫后乳汁中PEDV的IgA 抗体持续时间

2.2.1 2次猪腹泻二联活苗免疫IgA持续时间检测 结果如表2所示，2次猪腹泻二联活苗免疫组(第2组)母猪乳汁中IgA抗体在前6天阳性率为100%，第9天阳性率开始下降至80%，第12天降至70%，第15天降至10%，在猪群中10%的仔猪有抗体，对于抵抗病毒感染基本不起作用；IgA抗体可持续9～12 d；从阳性样品的平均OD值看，母源抗体也呈现逐渐衰减趋势。

表2 2次猪腹泻二联活苗免疫乳汁中IgA抗体动态变化

2.2.2 2次猪腹泻二联活苗加1次猪腹泻二联灭活苗免疫IgA持续时间检测 结果如表3所示，2次猪腹泻二联活苗加1次猪腹泻二联灭活苗免疫组(第4组)母猪乳汁中IgA抗体在前6天阳性率为100%，第9天阳性率为90%，在第12天降至70%，第15天降至40%；IgA抗体可持续12～15 d;从阳性样品的平均OD值看，母源抗体也呈逐渐下降衰减趋势，比单纯2次猪腹泻二联活苗免疫下降稍缓和。

表3 2次猪腹泻二联活苗加1次猪腹泻二联灭活苗免疫乳汁中IgA抗体动态变化

加1次猪腹泻二联灭活苗免疫的目的是尽可能维持IgA持续时间，从表2和表3结果可知，加1次免疫能增加母源IgA抗体持续的时间，但是会增加免疫成本且影响工作效率，在实际工作中可根据情况选择免疫2次或免疫3次，本试验结果表明免疫2次猪腹泻二联活苗获得IgA抗体持续的时间可以保护仔猪度过危险期。

3 讨论

大量的研究表明，猪流行性腹泻的免疫主要依靠黏膜免疫，高水平的母源IgA抗体与保护仔猪抵抗PEDV感染呈正相关，初乳中的PEDV 中和抗体滴度与血清中的IgA 抗体具有相关性[3],通过刺激动物机体产生高水平的分泌型IgA抗体，是PED疫苗免疫和防治的关键。本试验通过比较猪腹泻二联活苗与灭活苗的不同免疫组合对母猪初乳中IgA抗体水平的影响，得出接种2次猪腹泻二联活苗加1次猪腹泻二联灭活苗的母猪初乳中IgA抗体水平最高，整齐度最好，但成本相对于2次猪腹泻二联活苗偏高，并且免疫操作多1次，增加工作量和母猪应激；其次是2次猪腹泻二联活苗组合。疫苗组合效果的顺序与王娟萍等[5]、王艳丰等[6]的研究结果相近，每个组合的猪只免疫后的阳性率有差异，可能与选用的灭活疫苗抗原含量有差异相关。从本试验结果来看，猪腹泻二联灭活苗单独使用免疫效果欠佳，一定要与猪腹泻二联活苗或活毒驯化配合使用，才能更好的发挥免疫作用。

徐宏军等[7]进行的仔猪攻毒保护试验结果显示，商品化PED灭活疫苗免疫组断奶仔猪出现腹泻，腹泻保护率为60%，未达到有效性标准。由于我国目前所使用的商品化灭活苗通常不能有效激发机体的黏膜免疫，这可能是灭活疫苗免疫保护效果不佳的原因之一，灭活疫苗需要与活疫苗组合免疫才能产生高水平抗体，本试验中2次猪腹泻二联灭活苗免疫产生的IgA抗体水平最差，与徐宏军等[7]的研究结论一致，因此不建议灭活疫苗单独使用。有研究表明，PEDV感染仔猪机体后，病毒的主要靶器官是肠道、肠系膜淋巴结,如果感染时间早、持续时间长，会导致消化器官严重的病理损伤[8]，肠道黏膜免疫中分泌型IgA抗体非常重要。通过后海穴注射疫苗，尤其是免疫弱毒活苗，可以很好的刺激母猪产生大量 IgA 抗体分泌到乳汁中形成分泌型IgA抗体，从而为新生仔猪提供被动免疫保护[9]。

综上所述，综合考虑养殖场实际操作情况和生产成本，推荐猪场猪流行性腹泻的免疫程序为：妊娠母猪产前40 d、20 d各免疫1次猪腹泻二联活苗，或产前60 d、40 d各免疫1次猪腹泻二联活苗，产前20 d于后海穴注射猪腹泻二联灭活苗，在加强基础母猪免疫的同时，也要注意加强对后备猪的免疫，加强生物安全设施升级，严格执行生物安全操作程序，进场人员远离传染源，通过生物安全操作程序严格处理进场物资、车辆、人员，切断传播途径，通过综合防控措施控制好PED。