不同抗体检测方法对猪口蹄疫疫苗临床免疫效果的评估

谭 涛 任静雷 倪春霞 辛俊宝 张淑刚*

（1礼蓝 （上海）动物保健有限公司，上海 200003；2杨凌金海生物技术有限公司，陕西杨凌 712100）

口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、可快速远距离传播的烈性动物疫病,在猪、牛、羊等偶蹄动物中易广泛传播,且是一类人畜共患传染病[1]。许多国家的口蹄疫呈地方性流行或大流行趋势,而疫苗接种可以限制疫病的流行并减少养殖业的经济损失。从口蹄疫疫苗的研究和临床应用情况看,当前口蹄疫的控制仍然以注射灭活疫苗为主[2-4]。

对于基层猪场而言,疫苗的选择和评估主要看免疫临床表现,具体来说就是注射疫苗后是否有副反应(安全性)和免疫保护率(效力)。养殖户习惯于用肉眼观察到的免疫保护率评估口蹄疫疫苗的免疫,这种方法不够科学。口蹄疫灭活疫苗以体液免疫为主,可以用抗体检测(阳性率、滴度)评估免疫效果。目前国内常用口蹄疫抗体检测方法主要有病毒中和试验(VNT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)2种方法,其中ELISA法又分为液相阻断法、固相竞争法和间接法,试剂盒生产厂家很多。为了解猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗的免疫效果,以及临床上不同抗体检测方法(试剂盒)的差异,本试验选用常用的5个品牌ELISA抗体检测试剂盒及病毒中和试验共4种检测方法,检测猪场免疫口蹄疫O型和A型疫苗后的抗体水平,为生产一线评估口蹄疫疫苗的免疫效果提供数据参考[5,6]。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择广东省佛山市某集团育肥场65日龄左右健康仔猪300头。

1.2 试验材料

猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-Ⅲ株),由杨凌金海生物技术有限公司提供。O型、A型ELISA抗体检测试剂盒分别购自兰州兽研生物科技有限公司(以下简称“兰州兽研生物”)、爱德士(IDEXX)、麦迪安(MEDIAN)、金诺(JNT)、标驰泽惠(BCZH)。

1.3 免疫及采血方案

根据猪场免疫程序,对选定的试验猪在65日龄左右进行第一次免疫,间隔30 d后进行第二次免疫,第一次免疫前、第二次免疫前和第二次免疫后30 d,每次固定相同栏位随机选取15头猪进行采血并分离血清,用于抗体检测。

1.4 抗体检测方法及结果判定

抗体检测采用液相阻断ELISA、固相竞争ELISA、间接ELISA和病毒中和试验等4种检测方法,检测试剂盒包含临床常用的5个品牌,各试剂盒名称、方法类别及阳性判定见表1。

表1 抗体检测试剂盒类别

2 结果与分析

2.1 ELISA抗体检测

对第一次免疫前、第二次免疫前和第二次免疫后30 d相同栏位试验猪各采集血清15份,用兰兽研、爱德士(EDEXX)、麦迪安(MEDIAN)、金诺(JNT)、标驰泽惠(BCZH)5种ELISA抗体检测试剂盒进行检测,阳性率结果见图1、图2。

由图1、图2可知,第一次免疫后O型和A型抗体都迅速上升,除JNT的A型外,其他抗体阳性率均在85%～100%,其他试剂盒检测显示第二次免疫后抗体阳性率均达到100%。5种检测试剂盒检测免疫后O型、A型抗体变化趋势相似,符合率较高,在一定程度上都能反映免疫后抗体产生的变化规律。

图1 不同检测方法口蹄疫O型抗体阳性率

图2 不同检测方法口蹄疫A型抗体阳性率

O型和A型口蹄疫疫苗免疫前的抗体属于母源抗体,第一次免疫前不同试剂盒之间的阳性率符合度比免疫后抗体阳性率符合度的差异要大,可能与各试剂盒的敏感性有关。用MEDIAN试剂盒检测的母源抗体阳性率比其他方法检测结果明显高,除上述原因外,对该方法或该次检测应进一步验证。本试验中,相比较于

其他试剂盒,JNT的A型试剂盒检出的抗体阳性率略低,在其他临床检测中也发现过类似情况,可能是包被的抗原与目前A型毒株的同源性偏低有关,但也不能排除试剂盒批次间或反应板间的差异[7]。

2.2 中和抗体检测

用微量细胞病毒中和试验检测采集的血清中口蹄疫抗体的试验结果见图3。微量细胞病毒中和试验中,检测到抗体即为阳性,代表有一定的保护力,但通常认为lgSN值≥1.51(lg32＝1.51)对猪只有较好的保护力。由图3的免疫前后抗体变化趋势可知,第一次免疫口蹄疫疫苗后其抗体水平迅速上升,抗体滴度lgSN＞1.51；第二次免疫口蹄疫疫苗后其抗体滴度lgSN＞2.0,说明此时的抗体水平对猪只产生了良好的保护力。ELISA抗体与之有相似的变化规律,也进一步证实了该口蹄疫疫苗的免疫效果和5种ELISA抗体检测试剂盒对临床检测的适用性。

图3 病毒中和试验 （VNT）抗体滴度

3 讨论

全球口蹄疫主要在非洲、中东、亚洲及南美洲部分地区流行。口蹄疫病毒的7个血清型中,O型和A型毒株的流行区域最广。2021年,东南亚地区口蹄疫疫情形势依旧复杂,柬埔寨、马来西亚、缅甸、泰国和越南等国均有疫情发生,且引发疫情的毒株有多种,对我国口蹄疫的防控存在一定威胁[1,8]。目前我国防控口蹄疫主要采用以免疫控制为主的策略,疫苗免疫是有效防控口蹄疫的综合措施之一,也是一种经济有效的方式[4]。口蹄疫临床免疫效果评估主要衡量群体免疫后抗体的合格率。《2022年国家动物疫病免疫技术指南》在免疫效果评价中推荐了ELISA抗体检测方法,并指出“免疫合格个体数量占免疫群体总数不低于70%的,判定为群体免疫合格”。

本试验用金海生物提供的猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-Ⅲ株) 免疫65日龄左右仔猪,用目前临床常用的5种口蹄疫抗体检测试剂盒检测免疫后抗体,除JNT的A型抗体外,其他疫苗第一次免疫后的抗体阳性率在85.7%～100%之间,第二次免疫后的阳性率为100%,证明疫苗免疫的有效性,也反映出不同检测方法的试剂盒之间存在微小差异。口蹄疫ELISA抗体检测试剂盒既有国产品牌也有进口品牌,包被的反应抗原和使用的酶标抗体也存在差异,这种差异会导致检测同一份血清或不同毒株免疫后抗体的阳性率出现一定差异。

口蹄疫病毒中和抗体试验(VNT)是口蹄疫抗体检测的“黄金标准”,本试验用微量细胞病毒中和试验对血清抗体进行了检测,发现各ELISA抗体阳性率与该方法有较高的符合率,说明目前ELSIA检测方法具有良好的适用性。本试验后续也采用Mya98、Cathay变异株、印度2001和A型流行毒株对金海生物口蹄疫疫苗免疫抗体进行了交叉中和试验,结果显示金海口蹄疫疫苗对目前流行毒株具有良好的交叉保护作用。

4 小结

试验结果显示,市面上的口蹄疫疫苗对猪群均具有较高的保护效果。养猪企业可以根据自己的生产经营状况,选择合适的口蹄疫疫苗。