低电离辐射对肝癌模型兔免疫功能的影响

张雨虹 郑一凡 任虹彦 杨强 李淼 荣玮 郝利国

(齐齐哈尔医学院 1医学技术学院，齐齐哈尔 黑龙江 161000；2病理学院微形态中心)

国际癌症机构发布的数据显示，2018年，全球新发癌症病患1 810万例，死亡人数960万，其中肝癌发病率和死亡率最高且呈逐年上升趋势，早已成为最致命的恶性肿瘤之一〔1～3〕。免疫治疗和靶向治疗已成为近年来肝癌治疗的重要手段，但其治疗的机制尚不清楚〔4〕。其中，低电离辐射对免疫功能具有重要意义〔5〕。研究表明低电离辐射对正常机体的免疫功能有增强作用，然而低电离辐射对患瘤机体的免疫功能影响报道较少〔6〕。本研究探讨低电离辅射对肝癌模型兔免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 正常家兔15只，4～5个月龄、体重2～3 kg，雌雄均可，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供，在动物实验中心饲养，条件为温度15～25℃，相对湿度40%～70%，饮用水及饲料均经灭菌处理。

1.2药品与仪器 脱毛剂(硫化钠)、75%乙醇、20%乌拉坦、安尔碘溶液、0.9%等渗生理盐水、青霉素、VX-2组织块(由哈尔滨医大学附属第四医院提供)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(江莱生物：上海将来实业股份有限公司)、酶标仪、离心机、恒温箱、数字化彩色超声诊断仪(飞一诺科技有限公司)、瓦里安直线加速器IX、切片机、显微镜。

1.3分组 将15只家兔采用随机数字表法分为空白组(正常家兔)、对照组(未经低电离辐射的肝癌模型兔)和实验组(经低电离辐射的肝癌模型兔)各5只。空白组不种瘤，不照射；对照组种瘤，不照射；实验组种瘤、照射。

1.4建模 (1)VX-2瘤块稀释液制备。把已成功在后腿种植荷瘤兔处死在无菌环境中，取出肿瘤组织，去除坏死组织，用眼科剪剪成组织碎块10份，加入等量的等渗盐水混匀，制成瘤块组织悬液，备用。(2)组织悬液种植。实验组和对照组家兔于术前禁食 24 h，禁水8 h，耳缘静脉注射麻醉(20%乌拉坦，5 ml/kg)，将麻醉的家兔仰卧位固定于实验台上，上腹部备皮，安尔碘消毒，使用B超机高频探头找到家兔肝脏位置，将准备好的组织液在超声引导下注射。术后，对实验组和对照组兔注射抗生素，并每天监测家兔状况。(3)照射。实验组于种植肿瘤15 d后，使用齐齐哈尔医学院第三附属医院放疗科瓦里安直线加速器Ⅸ对实验组家兔进行单次全身照射，照射剂量为75 mGy〔7,8〕。

1.5检测项目 (1)家兔血常规指标及血清中IgG、IgM水平检测:分别于照射前3 h和照射后第4、8天，取家兔外周血2～3 ml，交送齐齐哈尔医学院第二附属医院检验科进行检测。(2)家兔血清中白细胞介素(IL)-4含量检测：分别于照射前3 h和照射后第4、8天，取家兔外周血2～3 ml，2 500 r/min离心20 min，取上层血清，用ELISA检测IL-4水平。(3)巨噬细胞吞噬功能检测：于照射后第14天向家兔腹腔注射淀粉溶液，于照射后第15天向家兔腹腔注入2%鸡红细胞悬液，1 h后取出腹腔液进行涂片，采用瑞氏-吉姆萨复合染液染色，于油镜下观察巨噬细胞吞噬的鸡红细胞情况。每组载玻片于镜下选取10个视野分别计数200个巨噬细胞及吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，取平均值计算其吞噬百分率〔9〕。(4)家兔脾脏指数测定：于照射后第15天，处死所有家兔，取出3组家兔脾脏，称重并计算其脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量(g)/家兔体重(kg)。(5)肿瘤组织病理学观察：于照射后第15天，处死家兔，取出肿瘤组织后，立即放入10%的甲醛溶液固定，进行肿瘤组织石蜡切片制备，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色后，于镜下观察实验组与对照组家兔肿瘤组织的形态学差异。

1.6统计学分析 采用SPSS16.0软件进行配对t检验。

2 结 果

2.1一般情况 对照组和实验组接种肿瘤块3 d后，精神状态良好，可以自行进食和行走。 接种15 d后，对照组和实验组体重均减轻且精神状态不佳，对实验组进行低电离辐射。接种20 d后，对照组精神状况差，其中一只家兔拒绝进食，体重严重减轻，与接种后第24天死亡；实验组精神状态良好，体重开始回升，未出现死亡现象。于接种第30天处死所有家兔后解剖，发现对照组腹腔有恶臭味，大部分肝脏被肿瘤侵袭，腹腔脏器出现肿瘤转移现象，部分组织坏死化脓；实验组腹腔肝脏被肿瘤侵袭，但未出现转移。空白组在实验过程中状态未发生变化。

2.2B超监测 使用B超机高频探头(7～10 MHz)，每3 d对对照组和实验组家兔的肝脏移植肿瘤进行1次检测。接种肿瘤7 d后，观察到对照组和实验组家兔肝脏处有高回声团块，边界尚清，彩色多普勒血流显像示肿瘤内部呈短棒状血流信号，见图1。对照组和实验组肿瘤块长径变化在接种后第7天〔(9.96±0.50) vs (10.26±0.22)mm〕、第15天〔(17.84±0.48) vs (17.96±0.27)mm〕、第25天〔(32.30±0.64) vs (30.60±0.60)mm〕均无显著差异(均P>0.05)。

图1 对照组与实验组超声下肿瘤影像及实验组彩色多普勒肿瘤血流显像

2.3实验组家兔低电离辐射前后血常规指标变化 实验组照射后第4天各项指标较照射前明显下降，照射后第8天各项指标较第4天明显升高(P<0.05)，见表1。

表1 实验组照射前后血常规指标变化

2.4各组家兔低电离辐射前后IL-4分泌水平 实验组照射后第4天IL-4水平较照射前明显上升(P<0.05)；照射后第8天的IL-4水平较照射后第4天有所下降，但不具有统计学意义(P>0.05)。照射后，对照组IL-4水平较空白组明显下降，实验组IL-4水平较对照组明显上升(P<0.05)，见表2。

表2 各组照射前后IL-4分泌水平比较

2.5各组家兔低电离辐射前后IgG、IgM分泌水平 实验组照射后第4天的IgG、IgM水平较照射前明显上升(P<0.05)；照射后第8天的IgG、IgM较照射后第4天有所下降，但不具有统计学意义(P>0.05)，照射后，对照组IgG、IgM水平较空白组下降，实验组的IgG、IgM较对照组升高，均具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组照射前后IgG、IgM水平比较

2.6低电离辐射对3组家兔巨噬细胞吞噬功能、脾脏指数的影响 镜下观察到细胞核呈紫红色，胞质呈浅红色，可见被吞噬的鸡红细胞，见图2。对照组巨噬细胞吞噬百分率〔(67.69±2.00)%〕较空白组〔(79.55±1.38)%〕明显下降，实验组巨噬细胞吞噬百分率〔(75.26±1.55)%〕较对照组明显升高(均P<0.05)。对照组脾脏指数〔(0.44±0.02)g/kg〕较空白组〔(0.84±0.03)g/kg〕明显下降，实验组脾脏指数〔(0.76±0.02)g/kg〕较对照组明显升高(均P<0.05)。

图2 实验组巨噬细胞吞噬鸡红细胞(苏木素-伊红染色，油镜，×1 000)

2.7病理学检查结果 实验组可见灰白色肿瘤、伴灶性出血坏死、周边包膜完整。种植瘤呈类圆形或椭圆形、血供丰富、质地较硬，切开后可见液化性坏死。病理组织学切片检查，镜下可见大量纤维组织增生，炎细胞浸润，假小叶之间血管扩张充血。瘤细胞排列紊乱，呈条索或团块状，其间可见血窦，瘤细胞大小不等，形状不规则，胞质富含嗜酸性，细胞核大深染，异质性高，多见瘤巨细胞及病理性核分裂，见图3。高倍镜下转移性淋巴结见大量癌细胞巢，癌细胞体积大，核大深染，淋巴结的正常结构被完全破坏。对照组与实验组家兔肿瘤组织的大体标本与镜下切片观察并无显著差异(P>0.05)。

(×100)

(×400)

3 讨 论

研究表明，低电离辐射抑瘤效应不是通过对肿瘤直接杀伤，而是通过自身调节、提高机体免疫力的方式实现的〔10，11〕。低电离辐射的兴奋效应和适应性反应已经被广泛证实。低电离辐射可使一些细胞因子分泌、信号转导增强，免疫细胞的相互作用提高，进而提升机体的免疫功能〔12〕。本研究主要通过检测低电离辐射后肝癌模型兔的免疫学指标来研究其免疫功能变化。因肿瘤形态发生变化需要一定的时间，且病灶大小会因炎症、水肿、坏死等因素有所改变，不能准确反映肿瘤大小。故超声检测并未显示显著性差异。各组肿瘤病理学观察并无显著性差异，可能是因其移植瘤来源相同，且对于中晚期大负荷肿瘤，单用免疫治疗难以奏效，应将其视为辅助疗法配合手术。

低电离辐射诱导不同细胞因子的释放可增强或抑制机体的免疫功能，同时也可促使初始T细胞向辅助型T细胞转化、诱导Th1免疫反应转变为Th2免疫反应〔13，14〕。本研究结果显示，辐射后实验组较对照组IL-4水平有所升高，其机制可能在于低电离辐射活化免疫细胞促进其细胞因子的分泌与调节。IL-4主要由Th2细胞产生，且具有广泛的生物学活性，可以增强特异性和非特异性细胞的杀伤功能。其在机体免疫应答中发挥的作用是复杂的，IL-4可调节Th1/Th2细胞的平衡，参与体液免疫；也能通过上调干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达参与细胞免疫〔15〕。且研究发现IL-4可通过阻滞细胞周期来阻碍癌细胞的生长〔16〕。故低电离辐射或可通过上调IL-4分泌水平，来达到抑瘤效应。B细胞通过产生免疫球蛋白来发挥其在体液免疫中的作用，IgG、IgM 均为机体免疫功能评价的常用指标〔17〕。关于低电离辐射对体液免疫的研究较少，目前认为，低电离辐射可作为一种特殊的弱抗原，反复刺激B细胞的多克隆活化和诱导免疫球蛋白的形成，使机体体液免疫功能增强〔12〕。机体接受低电离辐射刺激后，可产生大量具有高亲和力的IgG、IgM抗体〔18〕。本研究结果说明低电离辐射可提升患瘤机体免疫球蛋白水平。

低剂量电离辐射对机体的作用是复杂多变的，既有免疫兴奋效应同时也伴随着有害效应〔19〕。实验组家兔照射后第八天的免疫球蛋白、IL-4分泌水平相较于第四天，并无明显差异，可能是因为电离辐射在抑制免疫抑制的同时损伤了机体的T细胞，具体原因尚不清楚。对照组呈下降趋势，可能是肿瘤导致T细胞亚群发生改变而使免疫功能处于抑制状态〔20〕。

机体受到辐射后，可引起细胞水平甚至是器官水平的变化，而造血系统是最敏感的靶器官之一。有文献报道，机体血液系统在短时期受到低电离辐射后会逐渐恢复，其机制可能在于低电离辐射对机体的生物学效应，持续时间较短〔21，22〕。如何在运用低电离辐射免疫兴奋效益的基础上最大程度地避免有害效应，仍是一个值得长期探讨的问题。

巨噬细胞在非特异性免疫中起重要作用，参与机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节等过程〔23〕。低电离辐射可直接增强巨噬细胞的反应性，也可促进淋巴细胞的细胞因子分泌，从而增强巨噬细胞吞噬功能〔24〕。本实验结果可证实低电离辐射对巨噬细胞吞噬功能的促进作用。脾脏是外周免疫器官，为各种成熟淋巴细胞聚集和发生免疫反应的场所，一定程度上可反映机体的免疫功能〔25～28〕。低电离辐射可促进胸腺细胞和脾细胞多种蛋白的表达量升高，还可促进其分泌多种细胞因子，参与免疫调节〔18〕；其对提高机体免疫功能可表现为细胞增殖动力学改变，如作用于胸腺、脾脏后，其增殖特性发生适应性变化，细胞周期缩短，增殖加快〔29〕。本实验结果提示低电离辐射促进脾脏淋巴细胞与脾细胞的增殖分化。

综上，低电离辐射对免疫系统的影响主要表现为免疫活性细胞数量及其细胞因子的分泌水平、免疫球蛋白的分泌水平、抗体形成能力和细胞因子调节等一系列细胞及分子水平变化，最终导致机体免疫功能改变，并且对机体免疫功能有正向调节作用。