VEGFA基因多态性与小于胎龄儿的易感性

刘慧 邵珊珊 黄锟 严双琴 刘雨薇 朱鹏 郝加虎 陶芳标

小于胎龄儿(small for gestational age,SGA)是指出生体重低于同胎龄出生体重第10百分位数或2个标准差的活产儿，发生率约为8%～13%[1]。与适于胎龄儿(appropriate for gestational age infant,AGA)相比，SGA的围产期患病率和死亡率较高，儿童期发生营养不良、认知行为异常以及成年后罹患高血压、糖尿病等心脑血管和代谢性疾病的风险增加[2]。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是胎盘血管生长发育的关键调节因子，可促进血管内皮细胞增殖、迁移及活化[3-4]，已有研究证实SGA胎盘VEGFA表达降低[5]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)对基因表达和功能可产生着重要影响，VEGFA基因变异或可通过改变VEGFA基因表达或VEGFA分泌影响胎盘血管生成导致SGA的发生。然而，目前相关研究较为少见。本研究采用巢式病例-对照研究设计探讨了VEGFA基因多态性与SGA易感性的关联。

对象与方法

1.研究对象：研究对象均来自马鞍山优生优育队列，该队列纳入了于2013年5月到2014年9月在马鞍山妇幼保健院建册并计划在该院分娩的孕妇共3 474例。在队列的单胎活产中共筛选出318例分娩SGA且无妊娠并发症(高血压或糖尿病)的母亲，按照1:1.5随机选取477例分娩AGA且无妊娠并发症的母亲作为AGA组，但仅有183例SGA母亲和298例AGA母亲提供了静脉血样本。因此，本研究共纳入481例孕妇，其中SGA组183例，AGA组298例。本项目已通过安徽医科大学生物医学伦理委员会审查(批号：20170283)。所有研究对象均签署知情同意书。

2.诊断标准：SGA为出生体重低于同胎龄婴儿平均体重的第10百分位的婴儿，AGA为出生体重位于同胎龄婴儿平均体重的第10百分位至第90百分位的婴儿[6]。

3.问卷调查：包括母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒、家庭月收入、母亲孕前体重指数(body mass index,BMI)和父亲BMI等。

4. SNP的选择及基因分型：使用QIAamp DNA Investigator试剂盒提取静脉血DNA。基于NCBI官方网站采用以下步骤筛选VEGFA基因上的潜在功能性SNP位点。首先，筛选位于3′UTR、5′UTR或编码区的错义突变、移码突变；然后，选择其中在中国汉族人群中的最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥ 0.1的位点；最后，进行连锁不平衡检验，保留高度连锁(r2≥0.8)位点中的一个进行研究。最终纳入7个SNPs(rs2010963、rs833061、rs10434、rs1570360、rs3025020、rs3025040、rs3025053)。使用上海天昊生物科技有限公司的imLDRTM多重SNP分型试剂盒进行基因分型，ABI3730XL分析仪进行测序，GeneMapper 4.1软件(Applied Biosystems,USA)分析基因型。为保证基因分型的准确性，对5%的样本实施双盲检测。

结果

1.研究对象一般情况：如表1所示，两组研究对象在母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒、家庭月收入和父亲BMI的分布差异均无统计学意义。但是SGA组母亲孕前BMI显著低于AGA组，差异有统计学意义。

表1 481例研究对象的基本特征

2.VEGFA基因多态性与SGA易感性的关联分析：除VEGFArs3025053外，其余位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，纳入后续分析。如表2所示，rs2010963位点的CC、GC和GG基因型在SGA组和AGA组的分布差异具有统计学意义。其他位点在两组之间的基因型分布差异无统计学意义。调整母亲年龄、文化程度、吸烟、饮酒、家庭月收入后，与携带rs2010963 CC基因型孕妇相比，携带GC基因型的孕妇分娩SGA的风险显著增加(共显性模型：OR=1.94，95%CI=1.12～3.35)；携带GC/GG基因型的孕妇分娩SGA的风险也显著增加(显性模型：OR=1.69，95%CI=1.01～2.83)。敏感性分析进一步校正母亲孕前BMI和父亲BMI后，结果仍有显著性(显性模型：OR=1.75，95%CI=1.03～2.98)。但是，经FDR校正后rs2010963变异与SGA易感性关联的显著性消失(P=0.222)。基于1000 Genome database(https://www.internationalgenome.org/)公共数据库查询到rs2010963位点在中国汉族人群中的MAF为0.440。随后根据Power 3.0计算[7]，对于rs2010963位点在中国汉族人群中的MAF为0.440，在α=0.05 的检验水平下，SGA发病率为10%时，本研究的样本量有78%把握度能检验出OR=1.7的关联性。未发现其他5个SNP位点与SGA发生风险之间有显著关联性。

讨论

VEGFA基因位于染色体6p21.3，其编码蛋白是一种强有力的血管内皮生成因子,可影响血管通透性，调节早期胎盘血管的发育[3]。本研究结果提示，孕妇携带VEGFArs2010963 G等位基因可能会增加分娩SGA的风险。之前有一项基于澳大利亚和新西兰人群的研究探讨了VEGFArs699947和rs3025039与SGA关联性，没有发现其与SGA相关[5]。本研究在中国汉族人群中也没有发现与VEGFArs3025039高度连锁的rs3025040与SGA显著相关。

目前虽然没有发现VEGFArs2010963与SGA易感性的报道，但国内外关于VEGFArs2010963与低出生体重和子痫前期的研究已较多。BanyaszI等[8]在128例低出生体重儿和200例健康足月儿中开展的巢式病例对照研究，结果显示VEGFArs2010963 C等位基因增加了婴儿低出生体重的发生风险。这与本研究发现G等位基因会增加SGA的发生风险是相反的。VEGFArs2010963多态性对子痫前期的影响在不同研究间也存在不一致性。在中国[9]和匈牙利[10]人群中，携带rs2010963 G等位基因的母亲对子痫前期的易感性降低，但在菲律宾[11]和突尼斯[12]人群中发现该等位基因与子痫前期无显著关联。遗传背景的种族差异可能是导致不同研究结果的重要因素。rs2010963的G等位基因在中国人群、欧洲人群和美国人群的频率分别为0.596、0.720和0.628。此外，环境因素没有被充分考虑和控制也可能是各研究结果不一致的原因。

表2 VEGFA位点多态性与SGA易感性的多因素Logistic回归模型分析

本研究采用巢氏病例对照研究设计探讨了母亲VEGFA遗传变异与SGA易感性的关系，结果提示携带G等位基因的孕妇分娩SGA的风险增加。但存在以下局限性。首先，经过FDR校正后，rs2010963变异对SGA的发生风险的影响无显著性，虽然在本研究的样本量之下，有78%的把握度检验出rs2010963变异与SGA易感性的关联性，但是对于MAF较小的位点，本研究的样本量所能达到的把握度有限，需要更大的样本再次验证。其次，本研究缺乏rs2010963致VEGFA表达下调或功能损害的直接证据。VEGFA遗传变异与SGA易感性的研究有待进一步的深入探讨。