膝关节骨关节炎患者关节液中蛋白质组学的变化及意义

膝关节骨关节炎 ( knee osteoarthritis，KOA ) 是一种会影响整个关节结构的退化性慢性疾病，其特征在于软骨的逐渐退化和软骨下骨的改变。据报道，骨关节炎 ( osteoarthritis，OA ) 的总体患病率为5%～14%

。在欧洲国家据预测，到 2022 年，将有超过 6000 万人受到 OA 的影响，我国男性 OA 的发病率为 58%，女性更上升至 65%～67%

。KOA主要是由于机械负荷和炎症使关节组织损伤所致，但 KOA 高发的根本原因仍不清楚，并且相关研究还不充分，影响其预防和治疗

。为了加速 KOA 的研究从被动干预转向主动的早期预防和治疗转变过程，需要对发病机制有透彻的了解，并结合有效的诊断生物标志物来指示疾病的发生发展。近年来，科研工作者在探索 KOA 早期诊断、病情预估的生物标记物中开展了大量科研工作。快速发展的基因组学、蛋白质组学、肽组学、代谢组学等组学平台为筛选 KOA 生物标记物开拓了新的思路

。

习近平总书记指出：“我们既要绿水青山，也要金山银山。”“保护生态环境就是保护生产力，改善生态环境就是发展生产力。良好生态环境是最公平的公共产品，是最普惠的民生福祉。”

蛋白质组学技术使研究人员能够快速阐明疾病的发病机制，并揭示包括血清、关节液和尿液在内的独特体液中的生化标志物。因此，蛋白质组学研究越来越多地用于测量 OA 患者的体液

。在上述生物流体中，尿液是 OA 蛋白质组学研究的理想来源。与血清和关节液相比，它易于获取并且可以无创收集

。但 OA 患者尿液中蛋白水平的变化可能受体内其它疾病的影响，并不能完全反应 OA 的变化，但关节液中蛋白水平的变化则可以。鉴于关节液蛋白组学在 OA 中的独特优势和应用的可行性，本研究纳入 2017 年 8 月至 2018 年 10 月，新疆维吾尔自治区中医医院骨关节科膝关节滑膜切除患者为研究对象，采用同位素标记相对和绝对定量( isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ ) 的方法筛选 KOA 关节液中的差异蛋白，分析其通路并验证其在体内表达。

资料与方法

一、纳入标准与排除标准

1.纳入标准：( 1 ) 符合《骨关节炎诊治指南( 2018 年版 ) 》中相关诊断标准

者；( 2 ) 单膝患病者；( 3 ) 根据 Kellgren-Lawrecne 分期标准诊断分期为 Ⅱ、Ⅲ 期者；( 4 ) 年龄 30～80 岁者。

2.排除标准：( 1 ) 对花粉及其它药物有过敏反应史者；( 2 ) 并发严重感染疾病、恶性肿瘤、凝血障碍、先天性疾病和其它可能引起并发症的疾病者；( 3 ) 存在除 KOA 外其它类型的关节炎者；( 4 )有注射透明质酸或皮质类固醇史情况者；( 5 ) 妊娠妇女或哺乳期妇女。

目前各在运核电厂依据《核电厂营运单位报告制度》中的建造阶段事件的报告准则向国家核安全局上报建造事件，报告准则包含：违反认可的质保大纲的要求；最终设计违反认可的初步安全分析报告中的承诺或违反建造许可证条件；不符合法规、标准、技术条件或其他设计要求的建造活动或物项；建造或施工中的重大偏差、缺陷、故障或损坏、可能导致不满足预期使用要求和安全功能的物项或者需要重新评价验证的物项或活动等。

二、一般资料

本组共纳入 40 例 ( 试验组 )，其中男 22 例，年龄 30～75 岁，中位年龄 53 岁；女 18 例，年龄30～76 岁，中位年龄 48 岁，BMI 为 20～28，平均24。患者手术方式主要包括人工膝关节置换手术及膝关节镜手术。KOA 的诊断由膝关节正侧位 X 线片( Kellgren-Lawrence 放射学诊断标准 ) 和临床检查结果共同判定

。从健康检查中心招募了 40 名年龄、性别和 BMI 匹配的无 KOA 的个体作为正常对照组。其中男 22 例，年龄 32～73 岁，中位年龄 50 岁；女 18 例，年龄 35～70 岁，中位年龄 45 岁，BMI 为20～28，平均 23。本研究在新疆维吾尔自治区中医药研究院完成并获得研究院伦理委员会的同意，所有最终参与研究的对象阅读后同意并签署知情同意书。

我小学同学的母亲、有一半东欧血统且在苏联多年的亚兰阿姨，在1982年左右曾专门跟我说过“三种树比拟三种人”，印象深刻，令人叫绝，但我却一直没有替她写出来，欠疚至今。

三、关节液收集

试验者取仰卧位，试验膝置于床椅边保持放松、伴直位。取髋骨上方、股四头肌外侧为穿刺进针点，75% 酒精棉球消毒皮肤，用无菌 5 ml 注射器取少量 0.5% 利多卡因于穿刺点皮下局部麻醉。选取5 ml 注射器换上 1 ml 注射器的针头，刺入关节腔。将收集的关节液注入无菌 Eppendorf 管内，以 3000 rpm的速度在 4 ℃ 下离心 30 min。小心吸取上清液后置于 -80 ℃ 冰箱内备用。

四、试验设计

最终的对数转换数据计算采用 Perseus 1.3.0.4。当满足

＜ 0.05 和比率 ＞ 1.50 或 ＜ 0.66 时定义为差异表达的蛋白质。通过参考实验中内部控制的分布来指定比率截止值。PANTHER 平台 ( http://www.pantherdb.org/ ) 用于基因本体论 ( gene ontology，GO ) 注释

，从细胞组分 ( cellular component )、分子功能 ( molecular ftunction ) 和生物过程 ( biological process ) 层次立体化分析差异蛋白的功能网络。网络和路径分析通过路径分析软件 IPA 分析完成。层次聚类分析通过 Perseus 软件完成。

笔者用酶联免疫吸附实验 ( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ) 的方法验证了炎性细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 在汉族和维吾尔族对照组和病例组中的表达。结果表明，试验组血清中IL-1β、IL-6 和 TNF-α 均显著高于对照组 (

＜ 0.05 )。

五、胰蛋白酶消化和 iTRAQ 标记

总蛋白质含量通过 Bradford 方法测定：通过与标准曲线比较采用 559 nm 处的吸光度来定量总蛋白质。取 200 μg 蛋白变性，烷基化，然后在 37 ℃ 的胰蛋白酶消化过夜。按照说明书要求取 100 μg 蛋白质与 1 单位 iTRAQ 试剂混合后，制备成为标记蛋白。将标记的蛋白质与流动相 A 混合，并在 RIGOL L-3000 系统中以 0.7 ml / min 的流速均匀上样到色谱柱上。逐步注入流动相 B 以 300 nl / min 洗脱样品。使用移动设备 B 的阶跃梯度收集最终洗脱液。

原始数据通过 ProteoWizard 版本 3.0.8789 提取。根据 SwissProt 数据库搜索了 Mascot。半胱氨酸的氨基甲酰甲基化和赖氨酸的 iTRAQ 8 plex 指定了固定修饰。通过蛋氨酸的氧化，N 末端的乙酰基和酪氨酸的 iTRAQ 8 复合体进行了各种修饰。使用支架 Q + 版本 4.4.8 计算标记的肽和蛋白质的丰度。肽的接受阈值为 91% 的概率，错误发现率 ( false discovery rate，FDR ) 设定为 ＜ 1.0%，而相应的蛋白质接受值分别为 99.0% 和 1.0%，使用 median 将所有实验中获得的强度标准化。

六、质谱仪分析

质谱仪分析在 Q-Exactive 质谱仪和液相色谱系统 ( Thermo，美国 ) 上完成。含 A 相和 B 相二元溶剂系统中加入标记的肽后进入质谱分析步骤。洗脱液引入配备有 EASY-Spray 离子源的质谱仪，该质谱仪的预设参数为：喷雾电压 2.3 kV，毛细管温度320 ℃，完全质谱 ( mass spectrometry，MS ) 模型，离子转移 20 ms，质子数 / 电荷数范围 300～1800，强度阈值 8.30 E + 03，雾化气 32%。

七、数据库搜索

“钢琴过了八级，长笛是我们学校交响乐队首席，花样滑冰现在我在做教练助手，垒球我曾代表学校出访过很多国家。”

八、蛋白质统计分析

选择 4 例 KOA 患者 ( KOA 1～4 ) 和 8 名正常对照 ( Con 1～8 ) 的关节液裂解，并提取蛋白质。将两组中编号 1～4 的样品混合，用作质量控制。通过iTRAQ 标记方法标记所有这 16 个样品 ( 4 例患者，8 名对照和 4 种混合物 )，然后通过质谱分析法进行分析。通过蛋白质印迹法鉴定并确认了 KOA 患者中差异丰富的蛋白质。

九、血清指标检测

通过临床和影像确诊为 KOA 的患者入院后，按照医嘱前夜少食，次日清晨 8 点左右抽取 3 ml 静脉血。同期选取性别年龄匹配的健康人群为对照组，4 ℃ 条件下静止过夜，分离血清。分离后的血清在4 ℃ 放置，并采用酶联免疫吸附法及时测定肿瘤坏死因子-α ( tumor necrosis factor-α，TNF-α )、白介素-6( interleukin-6，IL-6 ) 和白介素-1β ( IL-1β ) 浓度，比较变化情况。

十、蛋白免疫印迹分析

蛋白免疫印迹 ( Western blot ) 分析目标蛋白表达，包括 Ⅳ 型胶原蛋白 ( type Ⅳ collagen，COL-4，1∶1000；Abcam，USA )，基质金属蛋白酶 9 ( matrix metalloproteinase-9，MMP-9，1∶1000，Abcam，USA )，水通道蛋白 1 ( aquaporin 1，AQP1，1∶1000；碧云天，南京 )，水通道蛋白 3 ( AQP3，1∶1500；碧云天，南京 )，丁甜菜碱双加氧酶 1 ( butyrobetaine dioxygenase 1，BBOX1，1∶2000；Abcam，USA )，纤维介素蛋白 2 ( fibrin 2，FGL2，1∶1000；碧云天，南京 )。步骤如下：用含 0.1% PMSF 的 RIPA 裂解液消化 30 μg 蛋白关节液蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯 ( polybutylcyanoacrylate，PBCA ) 法测定蛋白浓度。取等量蛋白在制备好的 12% 的聚丙烯酰胺凝( polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE ) 胶中电泳后将蛋白转印至聚偏氟乙烯 ( polyvinylidene fluoride，PVDF ) 膜上 ( 电压为 60 V )。5% 脱脂奶粉封闭 1 h 后用磷酸缓冲盐溶液 ( phosphate buffer saline，PBS ) 洗净，添加相应一抗孵育过夜 ( 置于 4 ℃ 冰箱中 )。用 PBS 清洗后，用二抗 ( 辣根过氧化物酶，1∶2500；Abcam，USA ) 耦联在室温下孵育 40 min。在膜上滴加化学发光试剂后成像，电泳凝胶成像分析系统分析灰度值。

结 果

一、关节液蛋白测序患者的一般资料

在试验组随机选择 4 例，按照年龄和性别匹配的原则在对照组中选择 8 人收集关节液。结果两组BMI 差异无统计学意义 ( 56.8±1.0

57.3±1.3，

=0.86 )，KOA 患者的 K-L 等级均为 4 级 ( 表1 )。

二、KOA 关节液蛋白组图谱

在试验组和对照组之间总共定量了 1412 种蛋白质。其中

＜ 0.05 的蛋白质 178 个。对于差异丰富的蛋白质的分配，进一步筛选了同时满足以下两个条件的蛋白质

：( 1 ) Student

检验

＜ 0.05；( 2 ) 与对照组相比，其比值 ＞ 1.50 或 ＜ 0.66。共产生 102 种差异表达的蛋白质 ( differentially expressed protein，DEP )，包括 56 种下调的蛋白质 ( 比值 ＜0.66 ) 和 46 种上调的蛋白质 ( 比值 ＞ 1.50 )，上调前10 和下调前 10 的蛋白见表2。差异蛋白的分层聚类结果表明 102 种蛋白质在列上分为两组，在行上也分为两组。在列方向上疾病或对照状态正确一致，没有一个样本作为 outsider，证明了该试验的有效性( 图 1 )。

三、基因本体注释分析

花鸟画作为我国传统绘画题材的重要组成部分，凭借其独特的艺术魅力俘虏了众多画者与欣赏者的心。在传承与发展的过程中，通过不断地发展和创新形成了三种各具魅力的花鸟绘画方式，工笔花鸟画，写意花鸟画，兼工带笔花鸟画，都各有特色，各有美感。

四、路径和网络注释分析

在这项研究中，笔者应用了尖端的 iTRAQ 方法探索 KOA 和正常对照组关节液中的总蛋白质和差异表达的蛋白质。质谱检测到总共 1412 种蛋白质，其中 102 种蛋白质的丰度差异显著 (

＜ 0.05 和比值 ＞1.50 或 ＜ 0.66 )。发现的蛋白质可能在蛋白质水平上为KOA 的发病机制及其潜在的生物标志物提供了依据。

五、炎症反应信号通路相关因子的验证

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六、差异关键蛋白在两组中的表达验证

为了确定新的潜在标记，通过 PubMed 文献分析了差异丰富的蛋白质的功能。最后，通过蛋白质印迹分析进一步检测了 6 种与 KOA 发生发展可能相关的蛋白质 ( COL-4、MMP-9、AQP1、AQP3、BBOX1 和 FGL2 )。结果显示，与对照组相比，KOA患者血液中 COL-4、MMP-9、AQP1 和 AQP3 均显著增加，BBOX1 和 FGL2 显著减少 ( 图 4 )。

GO 分析结果表明，蛋白质涉及细胞膜 - 细胞膜物质交换 ( 30.4% )，细胞外区域 ( 25.0% )，细胞部分( 16.1% )，细胞连接 ( 8.9% )，细胞外基质 ( 8.9% )，大分子复合物 ( 7.1% ) 和细胞器 ( 3.6% )。此外，对生物学过程的分析区分为以下 13 类：细胞过程( 22.7% )，代谢过程 ( 20.5% )，发育过程 ( 10.9% )，对刺激的反应 ( 8.7% )，多细胞生物过程 ( 7.9% )，生物调节 ( 7.0% )，生物黏附 ( 7.0% )，定位 ( 6.1% )，免疫系统过程 ( 5.2% )，细胞生物发生 ( 2.6% )，生殖 ( 0.4% )，机体 ( 0.4% ) 和细胞杀伤 ( 0.4% )。此外，通过分子功能分析将蛋白质分为 6 类，分别为催化活性 ( 35.3% )，结合活性 ( 34.6% )，受体活性 ( 15.8% )，转运蛋白活性 ( 6.8% )，信号转导活性( 4.5% ) 以及结构分子活性 ( 3.0% ) ( 图 2 )。

讨 论

将鉴定出的 102 种差异丰富的蛋白质提交给IPA 软件，以分析途径和网络功能。路径分析表明，肝纤维化 / 肝星状细胞活化是涉及的最主要途径。其它随后的途径是 TNF-α 信号通路，细胞外信号调节激酶 5 ( extracellular signal regulated kinase 5，ERK5 ) 信号转导，信号转导及转录活化因子 3 ( signal transducer and activator of transcription 3，STAT 3 )途径，核因子 κB ( nuclear factor kappa B，NF-κB )信号转导，X 受体 / 类视黄醇 X 受体 ( X receptor /retinoid X receptor，LXR / RXR ) 活化和神经胶质瘤入侵信号等 ( 图 3a )。差异丰富的蛋白质的网络分析由 16 个蛋白组成。排名第一的蛋白得分最高，为43，其与“心血管系统发育和功能，细胞运动，结缔组织疾病”等有关 ( 图 3b )。

OA 的病因是多方面的，涉及许多风险因素，包括年龄、性别、体重、创伤和炎症。本研究中，笔者设定了严格的入组标准，以匹配两组之间的这些因素。在智能路径分析中，第 1 个分配的网络包括结缔组织疾病。对于像 KOA 这样的“磨损”疾病，结缔组织存在降解

。在关节软骨中，很少有人关注诸如 COL-4。本研究中，COL-4 ( 最早发现于关节软骨的细胞间质 ) 蛋白在 KOA 患者中表达较低。胶原蛋白的研究表明，它们与多种结缔组织疾病有关，尤其是退化性关节疾病。

MMP-9 是另一种值得注意的蛋白质，与 OA 的退化机制有关。MMP 家族可能影响关节炎的疾病过程中层粘连蛋白和胶原蛋白分解

。本研究中，MMP-9 在 KOA 关节液中明显被抑制，这可能提示KOA 软骨中破坏性的细胞外基质形成。MMP-9 是一种明胶酶，是 MMP 家族中最复杂的成员，具有针对Ⅳ 型胶原的蛋白水解活性。与 KOA 早期关节软骨退变有关的生物标记物包括多种基质降解酶，例如MMP 家族具有血小板反应蛋白 1 型基序的双整合素和金属蛋白酶、软骨聚集蛋白聚糖酶等

。

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此外发现水通道蛋白家族的两个成员 AQP1 和AQP3 在 KOA 组中上调。Mobasheri 等

在马关节软骨细胞中发现 AQP1 和 AQP3 除了参与运输水之外，还在小分子溶质和活性代谢产物等一些物质通过软骨细胞的浆膜中发挥重要作用。研究还表明，当发生关节病变时，关节内的软骨细胞内外渗透压环境改变，软骨间质遭到破坏，导致 AQPs 家族蛋白在体内表达变化，增加细胞膜水通透性

。

蛋白质组学的途径分析表明，肝纤维化 / 肝星状细胞活化是差异蛋白发挥作用最主要的途径。其中，排名前 10 的蛋白中 FGL2 在调节肝脂质代谢中起关键作用

。此外，已有研究证实，与对照组相比，FGL2 在 OA 患者的血浆中高表达，而在肥胖人群中低表达

。BBOX1 是负责左旋肉碱生物合成的酶，在 OA 患者中较低。据报道，血脂异常在 OA中起关键作用，可能是一个危险因素

。因此，GO 生物学过程证实了代谢过程在 OA 病理过程中很重要。本研究证实，FGL2 和 BBOX1 的关节液中的浓度差异可以作为判断 KOA 的一种方式。然而，FGL2 和 BBOX1 在 KOA 病理生理中的确切机制仍然未知。

通过组学筛选的差异蛋白质应能代表 KOA 这种复杂疾病发生发展的多个方面。因此，笔者提出了差异蛋白列表中的 6 种蛋白作为 KOA 生物标志物的潜在候选物。为了阐明这些蛋白质在 KOA 发病中的机制和作为生物标志物及靶向药物开发的可能性，需要对这些蛋白质的生物化学机制进行进一步研究。

综上所述，通过分析 KOA 关节液中的蛋白质表达谱，确定 COL-4、MMP-9、AQP1、AQP3、BBOX1和 FGL2 作为 KOA 中的候选生物标志物。对这些新型生物标记物的进一步研究将有助于了解 KOA 的病理状况、药物开发或干细胞研究，并改善早期诊断和治疗。

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