牡荆素诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用

王 娜，张 霞，王玉净，张华林，孟亚丽

(河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050000)

宫颈癌为威胁妇女生命健康的重大疾病，全球每年约有50万新发病例，且其致死率高居女性恶性肿瘤第四位[1]。近年来，随着宫颈癌筛查手段及水平的提高，宫颈癌发病率明显下降，但仍然有一大部分患者确诊时即为晚期而失去了手术的最佳阶段[2]。目前，化疗仍然是复发和晚期宫颈癌患者最主要的治疗手段[3]。中药治疗宫颈癌具有低毒副作用、疗效显著、价格低廉等优点，引起了广大研究者的关注[4]。

牡荆素是来源于牡荆子和牡荆叶中的天然黄酮类化合物，具有预防心肌缺血再灌注损伤、降血糖、神经保护、止痛、抗氧化、抗炎等生物活性[5]。研究发现，牡荆素能呈时间-剂量依赖性的抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，并诱导凋亡[6]。姜玲等[7]证实在体外牡荆素能抑制卵巢癌SKOV3细胞系干细胞样细胞球的形成，但牡荆素抑制肿瘤细胞增殖的机制并未阐明，且其对宫颈癌的抑制作用相关报道较少。因此，本研究以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，在证实牡荆素具有抑制其增殖作用的基础上，进一步探讨与凋亡及细胞周期的关系，初步阐明其作用机制，以期为后续临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 牡荆素(纯度>96%，南京道斯夫生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培养基(美国Gibco公司)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)；细胞周期检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E、GAPDH多克隆抗体(美国CST公司)。

1.2 仪器 YSK-239型高速离心机(美国Sigma公司)；IX7型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；Multiscan-GO酶标仪(美国Thermo公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；Mini-Protean小垂直板电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 细胞株 人宫颈癌HeLa细胞购于中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 HeLa细胞增殖 HeLa细胞培养至对数生长期，离心收集细胞并用完全培养液重悬，调整细胞密度为1×105/mL。取100 μL胞悬液于96孔细胞培养板中，培养24 h后，弃去培养液，分为对照组，牡荆素低、中、高剂量组，分别加入含终浓度为0、2.5、5、10 μmol/L牡荆素完全培养液，继续培养24、48、72 h。采用MTT法，于450 nm波长处测光密度(OD)值。

2.2 细胞凋亡率检测 HeLa细胞培养于6孔培养板中，按“2.1”项下方法分组处理，培养48 h后，离心并收集细胞于上样管中。依次加入Annexin V-FITC结合液150 μL、Annexin V-FITC 3 μL、PI 2 μL重悬细胞，在室温条件下于暗室内孵育15 min。加入磷酸盐缓冲液使终体积为500 μL，经300目筛子滤过后，上机检测，并通过Cell Quest软件分析。

2.3 细胞周期检测 HeLa细胞培养于6孔培养板中，按“2.1”项下方法分组处理，培养48 h后，离心并收集细胞于上样管中。在4 ℃条件下用预冷至0 ℃75%乙醇固定HeLa细胞0.5 h，加少量磷酸盐缓冲液重悬细胞，再加入适量PI使其终浓度为50 mg/L。在室温条件下于暗室内孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液使终体积为500 μL，经300目筛子滤过后，上机检测。

2.4 Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表达 HeLa细胞培养于6孔培养板中，按“2.1”项下方法分组处理，培养48 h后，离心并收集细胞于1.5 mL离心管中。在冰水浴下加入细胞裂解液裂解0.5 h，离心取上清，采用考马斯亮蓝法测总蛋白浓度。经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，并通过湿转法将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。用封闭液在4 ℃条件下封闭2 h，再用稀释后(1∶2 000)一抗(Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E)孵育过夜，二抗(1∶5 000)孵育2 h。采用ECL法显色，以GAPDH为内参蛋白，Image J软件对目的蛋白条件进行分析与半定量。

3 结果

3.1 牡荆素对HeLa细胞增殖的影响 与对照组比较，牡荆素各剂量组在24、48、72 h内HeLa细胞存活率均下降(P<0.05，P<0.01)，且随着药物浓度及作用时间的延长，细胞存活率越低，具有明显的剂量依赖关系及时间依赖关系，结果见表1。由此可知，牡荆素具有抑制HeLa细胞增殖的作用。

表1 牡荆素对HeLa细胞增殖的影响

3.2 牡荆素对HeLa细胞凋亡率的影响 与对照组比较，牡荆素各剂量组HeLa细胞48 h后的细胞凋亡率均增加(P<0.01)，结果见图1。由此可知，牡荆素对HeLa细胞凋亡率的诱导作用，随着作用剂量的增加而增强，表现出明显的剂量依赖关系。

注：与对照组比较，**P<0.01。图1 牡荆素对HeLa细胞凋亡率的影响(n=5)

3.3 牡荆素对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较，牡荆素各剂量组HeLa细胞Bcl-2表达降低(P<0.05，P<0.01)，Bax表达升高(P<0.01)，牡荆素中、高剂量组HeLa细胞caspase-3表达升高(P<0.01)，牡荆素低剂量组caspase-3表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图2、表2。由此可知，牡荆素具有HeLa细胞凋亡作用。

图2 牡荆素对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3.4 牡荆素对HeLa细胞周期分布的影响 与对照组比较，牡荆素各剂量组HeLa细胞S期细胞数减少(P<0.05，P<0.01)，而G1细胞数增加(P<0.05，P<0.01)，结果见图3。由此可知，牡荆素对HeLa细胞周期G1/S进程具有阻滞作用。

表2 牡荆素对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图3 牡荆素对人宫颈癌HeLa细胞周期分布的影响(n=5)

3.5 牡荆素对HeLa细胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表达的影响 与对照组比较，牡荆素组各剂量组HeLa细胞p-P53表达增加(P<0.01)，cyclin B1、cyclin E蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，结果见图4、表3。由此可知，牡荆素具有细胞周期阻滞作用。

4 讨论

细胞凋亡与肿瘤的发生发展关系密切，凋亡进程由多种基因严密调控，是一种为适应外部环境而进行的主动性程序死亡过程[8]。在众多的凋亡调控基因中，B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)在宫颈癌等多种肿瘤中表达异常，为细胞凋亡过程中的关键调控因子，已成为多种抗癌药物研发的热门靶点[9]。Bcl-2基因可阻断细胞凋亡进程，而作为Bcl-2同源基因的Bax则具有促进细胞凋亡作用[10]。细胞凋亡最主要的途径为线粒体凋亡途径，凋亡信号首先促使线粒体的通透性转换孔开放，随后使线粒体跨膜电位下降，进而导致线粒体膜功能障碍，引起半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的激活及表达增加，诱发caspase家族级联反应，最终使细胞发生凋亡[11]。本研究首先采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞法在细胞水平上，发现牡荆素具有诱导HeLa细胞凋亡的作用；进而采用Western blot法在分子水平上，证实牡荆素可以降低HeLa细胞Bcl-2表达、增加Bax、caspase-3表达，进一步提示牡荆素抑制HeLa细胞增殖作用与诱导凋亡有关。

图4 牡荆素对人宫颈癌HeLa细胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表达的影响

表3 牡荆素对人宫颈癌HeLa细胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表达的影响

近年来，细胞癌变与细胞周期的关系已成为广大研究者关注的焦点，通过靶向细胞信号传导途径中的相关蛋白，调节细胞周期进程[12]。除G0期、G1期、S期、G2期及M期外，G1/S期是最为重要的检查点，其可监测DNA合成的保真度和细胞组分的完整性[13]。本研究采用流式细胞术检测发现，人宫颈癌HeLa细胞经不同浓度的牡荆素处理48 h后，S期细胞数减少，而G1细胞数增加，提示牡荆素对HeLa细胞周期G1/S进程具有阻滞作用。p53蛋白是基因组的监护者，致癌信号、DNA损伤等细胞应激均会激活p53信号通路，进而活化多个下游途径，使细胞周期检查点G1/S期暂时停顿，诱导细胞凋亡及衰老[14]。细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶共同调控细胞周期的进程，其中细胞周期蛋白cyclin B1和cyclin E是促进G1期向S期转换的主要调节蛋白，若表达降低，则会导致G1/S进程受阻[15-16]。本研究发现人宫颈癌HeLa细胞经不同浓度的牡荆素处理48 h后，p-P53表达增加，而cyclin B1、cyclin E蛋白表达降低，进一步提示牡荆素具有阻滞细胞周期G1/S进程的作用。

综上所述，牡荆素可能通过诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和细胞周期阻滞，发挥抑制HeLa细胞增殖作用，为牡荆素治疗宫颈癌提供重要的实验基础，也可为牡荆素抗肿瘤作用机制的研究提供新的思路。