1例威宁鸡源ALV-J与MDV混合感染诊断及其遗传进化分析

韦秒粘，周 贵，陈 广，温贵兰，徐 飞，龚新勇，朱二鹏

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3义龙新区农林水务和移民局，贵州 兴义 562400 )

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)是一种能够引起宿主产生严重免疫抑制的反转录病毒，最终会导致宿主产生多种恶性肿瘤，严重的免疫抑制常常造成多种病原的混合感染，该病无明显临床症状、主要表现为头冠苍白，多器官组织肿瘤等特征。AL的亚群特异性是由表面的囊膜蛋白gp85决定的，gp85作为囊膜蛋白的主要成分，主要负责识别靶细胞膜上的特异性病毒受体，在感染时能刺激机体产生中和抗体，其抗原性可以决定病毒的亚群特异性，gp85高度的可变性导致ALV-J亚型基因具有高度多态性，同时反映出不同亚群的差异。根据ALV囊膜蛋白的特性可将其分为A～K共11个亚型，对鸡生产影响较为严重的分别是A、B和J亚型，在众多亚型中，J亚型的感染率最高。

鸡马立克病是由马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的，它的典型病症是发病鸡出现T淋巴细胞瘤和严重的免疫抑制，肿瘤主要发生于内脏器官，但也发生于肌肉和皮肤，根据临床症状可分为内脏型、神经型和眼型。MDV共有3种血清型，即血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)、血清3型(MDV-3)，但只有血清1型具有致病性和致瘤性，根据MDV-1致病性的强弱，可将其分为温和型(mild MDV，mMDV)、强毒型(virulent MDV，vMDV)、超强毒型(very virulent MDV，vvMDV)、超超强毒MDV(very virulent plusMDV，vvMDV)。相关研究表明，与MDV致肿瘤相关的基因有、、、等，其中基因是公认的主要致瘤基因，与MDV-1强弱毒株致瘤性的不同有关。

贵州威宁鸡作为一种肉蛋兼用鸡型，体质结实，结构匀称，骨骼粗壮，深受人们的喜爱，若威宁鸡受到ALV与MDV这两种疫病的侵害，将会对人们的生活造成巨大的阻碍，将会对养禽业造成巨大的经济损失。2020年9月份开始以临床发病呈劈叉主要症状约40日龄威宁鸡为对象，诊断其致病原因进行病原核酸的检测，并对其进行遗传进化分析，结果表明此病例为ALV-J与MDV混合感染，以期为该养殖场ALV与MDV混感提供一定的参考依据，为ALV-J与MDV混感的疫情防控提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料

病料采自贵州省威宁县某养殖场饲养的约40日龄疑似ALV与MDV感染的威宁鸡，现保存于贵州大学预防兽医学实验室-80 ℃冰箱中。

1.2 主要试剂及仪器

柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DL-DNA5000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；pMD-19T载体购自宝生物工程(大连有限公司)；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自碧云天公司；PCR扩增仪购自杭州柏恒科技有限公司；电泳仪电源购自北京百晶生物技术有限公司；电泳凝胶图像分析系统购自香港Gene公司。

1.3 方法

..临床观察及病变观察

为了解贵州威宁鸡疫病感染情况，对发病鸡观察临床症状及病变观察并记录结果。

..病料采集

在临床剖解完全暴露腹腔，观察病变组织，无菌采集疑似ALV与MDV的感染病变组织，如心脏等，装入提前标记好的采样袋中，于-20 ℃冰箱中保存，以待后期研究备用。

..引物设计

根据GenBank中的ALV-J毒株HPRS103登录号为Z46390和 MDV meq 基因组(登录号为EF546430)序列，利用 Premier 5.0软件设计两对特异性引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

..病原核酸检测

为检测样品中是否存在ALV与MDV抗原，以提取的病毒总DNA为模板分别进行PCR，扩增体系总体积为20 μL。PCR体系为：2×Taq MasterMix 10 μL，DNA/cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddHO 6 μL。

ALV的PCR 鉴定扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30个循环；72 ℃再延伸10 min。取PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察并记录结果。

MDV的PCR 鉴定扩增程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33个循环；72 ℃再延伸10 min。取PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察并记录结果。

..ALV-J与 MDV基因克隆与PCR鉴定

用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收 PCR产物后与 pMD-19T载体连接，然后转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，置 37 ℃培养箱中培养接种于含氨苄西林的LB液体培养基中，培养12～16 h，克隆并进行PCR鉴定，PCR扩增体系与程序同..，将阳性克隆质粒分别送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

..ALV-J与 MDV基因序列分析

为了辨别ALV-J基因属于哪一个亚群及MDV基因可能属于哪一个毒株型，利用 DNAStar 软件包中的 Megalign 软件分析ALV-J及MDV基因与NCBI上发布参考毒株的核苷酸同源性并绘制系统遗传进化树。ALV-J及MDV基因参考毒株信息分别见表 2和表3。

表2 ALV-J gp85基因参考毒株信息Tab.2 ALV-J gp85 gene reference strain information

表3 MDV meq基因参考毒株信息Tab.3 MDV meq gene reference strain information

2 结果与分析

2.1 威宁鸡临床观察及病变观察

疑似ALV与MDV混感病鸡，可见病鸡头冠苍白，精神沉郁，两腿呈劈叉状；剖解病鸡可见心脏有明显肿瘤结节(图1)。结果表明，发病鸡疑似存在ALV与MDV混合感染。

注：a为威宁鸡两腿呈劈叉状图;b为威宁鸡心脏可见明显肿瘤;c为威宁鸡心脏可见明显肿瘤。图1 威宁鸡临床观察及病变观察Fig.1 Clinical observation and lesion observation of Weining chicken

2.2 病原核酸检测

..ALV-J核酸检测

为检测病鸡是否存在ALV抗原感染，以提取的基因组DNA为模板进行PCR检测，结果见图2。待检样品3、4号可扩增出约931 bp目的条带，与预期大小相符，而空白对照组未见该条带，说明样品3、4号疑似存在ALV-J感染。

注：M为DL5000 Marker;1～4为样品;-为阴性对照。图2 ALV-J核酸PCR检测Fig.2 ALV-J nucleic acid PCR detection

..MDV核酸检测

为检测病鸡是否存在MDV抗原感染，以提取的基因组DNA为模板进行PCR检测，结果见图3。待检样品3号可扩增出约1020 bp目的条带，与预期大小相符，而空白对照组未见该条带，说明样品3号疑似存在MDV感染。

注：M为DL5000 Marker;1～4为样品;-为阴性对照。图3 MDV 核酸PCR检测Fig.3 MDV nucleic acid PCR detection

2.3 ALV-J gp85基因序列分析

..ALV-J基因克隆 PCR 鉴定

为确定PCR扩增出的DNA序列是ALV核酸片段，以扩增出ALV阳性样品3、4号提取的克隆菌液DNA为模板进行PCR检测，结果见图4。待检样品3、4号克隆均可扩增出约931 bp目的条带，与预期大小相符，而空白对照组未见该条带，说明样品3、4号疑似存在ALV-J基因感染。

注：M为DL5000 Marker;1～6为样品;-为阴性对照。图4 ALV-J gp85基因克隆 PCRFig.4 ALV-J gp85 gene cloning PCR

..ALV-J基因序列分析

根据测序结果，将ALV-J基因编码的核苷酸序列与GenBank 中已发表的不同亚群ALV参考株(见表2)的核苷酸进行同源性分析，结果显示ALV-J基因与ALV-J参考毒株核苷酸同源性为98.0%～99.7%，与 ALV-J基因参考株AHaq02核苷酸同源性高达99.7%，ALV-J基因与ALV-A的核苷酸同源性为49.3%～50.5%；ALV-J基因与ALV-B的核苷酸同源性为49.8%～49.9%；ALV-J基因与ALV-C的核苷酸同源性为50.2%～50.5%；ALV-J基因与ALV-D的核苷酸同源性为50.7%～51.3%；ALV-J基因与ALV-E的核苷酸同源性为51.2%～51.8%；ALV-J基因与ALV-K的核苷酸同源性为50.4%～51.2%(图5)。不同亚型参考毒株间核苷酸序列的遗传进化树分析显示，ALV-J基因与J亚群的参考毒株处于同一分支，表明ALV-J基因与J亚群ALV的亲缘关系较近，应属于同一亚型(图6)。

注：本研究基因标为“★”。图5 ALV-J gp85基因核苷酸同源性分析Fig.5 Analysis of nucleotide homology of ALV-J gp85 gene

注：本研究基因标为“★”。图6 ALV-J gp85基因核苷酸系统进化树分析Fig.6 ALV-J gp85 gene nucleotide phylogenetic tree analysis

2.4 MDV meq 基因序列分析

..MDV基因克隆 PCR 鉴定

为确定PCR扩增出的DNA序列是MDV核酸片段，以扩增出MDV阳性样品3号提取的克隆DNA为模板进行PCR检测，结果见图7。待检样品3号克隆均可扩增出约1020 bp的目的条带，与预期大小相符，而空白对照组未见该条带，说明样品3号疑似存在MDV基因感染。

注：M为DL5000 Marker;1～2为样品;-为阴性对照。图7 MDV meq基因克隆PCRFig.7 MDV meq gene clone PCR

..MDV基因序列分析

根据测序分析结果，将MDV基因编码的核苷酸序列与GenBank 中已发表的不同毒力MDV参考株(表3)的核苷酸进行同源性分析，结果显示MDV基因与超超强毒株(vv)的核苷酸同源性为98.7%～99.8%，与MDV基因参考毒株GXY2、YLO40920这两株毒株核苷酸同源性高达99.8%(图8)；不同毒力型参考毒株间基因核苷酸序列的遗传进化树分析显示，MDV基因与毒力型为超超强毒株型(vv)的参考毒株处于同一分支，表明MDV基因与vv的亲缘关系较近，可能属于同一毒力型(图9)。

注: 本研究基因标为“★”；m,温和型;v,强毒型；vv,超强毒型；vv+,超超强毒型。图8 MDV meq基因核苷酸同源性分析Fig.8 Nucleotide homology analysis of MDV meq gene

注: 本研究基因标为“★”；m,温和型;v,强毒型；vv,超强毒型；vv+,超超强毒型。图9 MDV meq基因核苷酸系统进化树分析Fig.9 Nucleotide phylogenetic tree analysis of MDV meq gene

3 结论与讨论

贵州威宁某养鸡场发病鸡的临床表现为精神沉郁，头冠苍白，两腿呈明显劈叉状，剖检可见心脏有明显肿瘤结节。张喜懿等发现贵州绿壳蛋鸡中存在ALV-J与MDV的混合感染；史荣华等发现肉种鸡中存在ALV与MDV的混合感染；威宁鸡作为肉蛋兼用型鸡，如果也存在这两种疫病的混合感染，将会对家禽业造成巨大的经济损失，便对发病鸡进行病原核酸检测和测序结果的测定，结果表明，发病鸡存在ALV-J与MDV的混合感染。

ALV-J于2000年首次在中国分离得到，该毒株宿主范围广泛、进化迅速，目前已成为最流行的禽白血病病毒亚型，ALV-J在贵州感染常有病例发生，为了解当地疫情感染，便对威宁鸡进行检测。测序结果显示，ALV-J基因与ALV-J原型毒株HPRS103基因核苷酸同源性达到98.0%且位于同一分支上，与ALV-J参考毒株同源性为98.0%～99.7%，说明基因ALV-J属于ALV-J。MDV的特征性临床症状为肢体的非对称进行性麻痹，继而发展为完全麻痹，因其侵害的神经不同而表现不同的临床症。最常见的是坐骨神经受侵害，表现步态不稳，后完全麻痹，不能行走，蹲伏地上，或呈典型的“劈叉”姿势，一腿伸向前方，另一腿伸向后方。MD存在于所有家禽业中，自1967年以来，给家禽业造成了巨大的经济损失。测序结果显示，MDV基因与超超强毒株(vv)的同源性为98.7%～99.8%，与MDV m型、v型、vv型各代表毒株不在同一个分支上，MDV基因与毒力型为超超强毒株型(vv)的参考毒株处于同一分支，故MDV基因可能属于vv型。

ALV没有可供使用的疫苗，也没有特效的治疗药物，只能靠预防。在生产中，禽群中一旦发生ALV，一般只能作淘汰处理。MDV是唯一可以用疫苗进行防治的肿瘤性疾病，虽然MDV有可供使用的疫苗，但疫苗不能阻止病毒的复制和传播，由于某些人为因素也可导致免疫失败，如不规范操作等。ALV和MDV都能使鸡群机体产生免疫抑制，共同感染两种病毒可促进疾病的发生、发展，故应引起重视，秉承以预防为主的理念，有效做好预防工作。