豫北夏玉米根际2种根腐线虫的形态和分子鉴定

胡瑶君 徐菲菲 任 航 夏艳辉 赵子尧 李 宇 李洪连 袁虹霞 王 珂

(河南农业大学 植物保护学院/小麦玉米作物学国家重点实验室，郑州 450002)

玉米是我国最重要的粮食作物之一，也是我国畜牧业、水产养殖业和化工业等产业的重要原料。河南省位于黄淮玉米优势产业带的中心区域，自然资源丰富，玉米种植面积和总产量均达到全国的10%。豫北地区地处黄淮海平原西部，光热资源充足，是河南省夏玉米的主产区和高产区。玉米在生长过程中会受到多种病原物的危害，植物病原线虫就是其中重要的病原物之一。据报道，植物线虫侵染能够使玉米的产量和品质严重受损，给世界农业生产造成极大危害。

短体属线虫(

Pratylenchus

Filipjev,1936)又称根腐线虫,是一类分布广泛，种类繁多的迁移性植物内寄生线虫，现已报道的有效种超过100个。根腐线虫主要危害玉米的根系，其穿刺和取食寄主薄壁组织引起的伤口为其它病原菌的侵入提供便利，造成病害复合侵染，大大加重作物的受害程度。玉米是根腐线虫危害的主要农作物之一，已有多种根腐线虫危害玉米的报道。高学彪等的研究结果表明斯克里布纳短体线虫(

P.

scribneri

)在华北省区的玉米上发生普遍，该线虫的侵染对玉米根系发育和地上部生长量影响显著，但该研究缺乏根腐线虫的分子鉴定数据；刘维志等对我国北方玉米主产区根寄生线虫的种类进行了系统调查，在江苏省玉米上发现有斯克里布纳短体线虫的发生危害，山东省玉米上有安地斯短体线虫(

P.

andinus

)、角基短体线虫(

P.

angularis

)和艾斯顿短体线虫(

P.

cstconionsis

)的发生危害，辽宁省玉米上有咖啡短体线虫(

P.

coffeae

)、斯克里布纳短体线虫、玉米短体线虫(

P.

zeae

)、铃兰短体线虫(

P.

cinvallarae

)、弗莱克短体线虫(

P.

flakkedsis

)、六裂短体线虫(

P.

hexincisus

)和卢斯短体线虫(

P.

loosi

)的发生危害，这些根腐线虫的侵染可造成植株的矮化和根系的腐烂；刘修勇等报道山东省玉米根部有艾伦短体线虫(

P.

alleni

)、咖啡短体线虫、六裂短体线虫、落选短体线虫、穿刺短体线虫(

P.

penetrans

)和斯克里布纳短体线虫的发生危害；郭宁等的研究表明短体属线虫在河南省和辽宁省玉米根际发生普遍，为两省区的优势属；Qiu等在山东省泰安市玉米根部分离出了斯克里布纳短体线虫和落选短体线虫；Li等首次在内蒙古赤峰市玉米根际发现斯克里布纳短体线虫的发生危害；夏艳辉等在豫西和豫东的玉米根际发现斯克里布纳短体线虫和咖啡短体线虫的侵染危害，但关于豫北地区玉米根际根腐线虫发生与分布的报道较少。本研究拟从形态学和分子生物学两方面对采自于豫北地区的2个根腐线虫种群进行种类鉴定，旨在了解豫北地区玉米根腐线虫的种类和分布情况，为今后玉米线虫病害的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与线虫分离

2020年9月，在河南省鹤壁市淇滨区刘寨村和焦作市武陟县乔庙镇宋陵村玉米田选取地上部矮小、长势弱且根系腐烂变褐的玉米病株，采集其根系及根际土壤样本备检。将样本根系剪碎后与根际土壤混匀，采用改良贝尔曼漏斗法分离根腐线虫。

1.2 根腐线虫的单雌扩繁

在体视显微镜下观察分离到的根腐线虫，依据形态特征分别从两地市样本中挑取8条雌虫，经0.3%的硫酸链霉素溶液消毒8 h后，单雌接种在胡萝卜愈伤组织上，25 ℃黑暗环境下培养3～5个月，最终得到了4个纯化的鹤壁种群和5个纯化的焦作种群。将采自于鹤壁市的纯化种群记为HB-1种群，将采自于焦作市的纯化种群记为JZ-257种群。胡萝卜愈伤组织的制备参照Reise等的方法。

1.3 形态学鉴定

参照王硕等的方法进行线虫的热杀死和固定：在体视显微镜下挑取纯化培养后的线虫，置于带有无菌水的凹玻片上，在酒精灯火焰上热杀死并快速挑至40 μL FG固定液(4%)中固定。进行加速固定的PCR热循环程序：95 ℃ 2 min，65 ℃ 10 min，75 ℃ 10 min，85 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，25 ℃终止反应，采用乙醇-甘油脱水法对固定的线虫进行脱水并制作永久玻片。在尼康光学显微镜(Nikon Eclipse Ti-S)下进行线虫的形态观察和拍照，并按De Man公式对线虫的形态特征进行测量。

1.4 分子鉴定

参照王江岭等的蛋白酶K法提取单条线虫DNA。使用高保真的KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO)，以(D2A：5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′,D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)和(18S：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′,26S：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)为引物,分别扩增HB-1和JZ-257种群的rDNA 28S D2-D3区和rDNA-ITS区序列。PCR扩增、产物纯化回收及连接转化等参照夏艳辉等的方法进行。PCR检测的阳性克隆菌液送公司测序，然后将所得序列在NCBI中进行BLAST比对。

1.5 系统进化树的构建

采用MEGA 7软件进行系统进化分析。根据BLAST比对结果从GenBank数据库中下载序列相似性较高的根腐线虫不同种及不同种群的rDNA 28S D2-D3区和rDNA-ITS区序列，使用Clustal W工具将本研究获得的根腐线虫序列与已下载的参考序列进行比对分析，基于邻接法(Neighbor-joining)构建供试根腐线虫与其它根腐线虫rDNA 28S D2-D3 和rDNA-ITS区序列的进化树，并采用自展法(Bootstrap method)对进化树分支进行可信度评估。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

根据短体属线虫种类的鉴别特征：如侧线数、唇区、口针长度、口针基部球形态和尾部形态等，对采自于豫北的2个根腐线虫种群进行种类鉴定。基于形态特征观察和形态测计值分析，并与Castillo等对短体属不同线虫种群的形态描述作比较，结果发现HB-1种群和JZ-257种群分别为斯克里布纳短体线虫和落选短体线虫(图1、图2和表1)。

(b)标尺为2 μm，(c)、(e)～(h)和(j)～(m)标尺为10 μm，(d)标尺为15 μm，(a)和(i)标尺为20 μm。(a)和(i)线虫整体；(b)唇区；(c)食道腺与肠重叠区及排泄孔；(d)阴门与后阴子宫囊；(e)侧线和侧区；(f)～(h)头部；(j)～(m)尾部。(b) Scale bar=2 μm, (c)， (e)-(h) and (j)-(m) Scale bar=10 μm, (d) Scale bar=15 μm, (a) and (i) Scale bar=20 μm. (a) and (i) Entire body; (b) Lip region; (c) Anterior and pharyngeal overlap regin,excretory pore; (d) Vulval and Post-uterine sac region; (e) Lateral lines and lateral field; (f)-(h) Head; (j)-(m) Tail.图1 根腐线虫HB-1种群雌虫形态Fig.1 Female morphology of Pratylenchus HB-1 population

(b)标尺为=4 μm，(c)～(e)标尺为10 μm，(a)和(f)～(m)标尺为20 μm。(a)和(m)线虫整体；(b)唇区；(c)、(d)和(f)头部；(e)阴门与后阴子宫囊；(g)食道腺与肠重叠区及排泄孔；(h)侧线和侧区；(i)生殖腺；(j)～(l)尾部。(b) Scale bar =4 μm, (c)-(e) Scale bar=10 μm, (a) and (f)-(m) Scale bar=20 μm. (a) and (m) Entire body; (b) Lip region; (c)， (d) and (f) Head; (e) Vulval and post-uterine sac region; (g) Anterior, pharyngeal overlap regin and excretory pore; (h) Lateral lines and lateral field; (i) Genital gland; (j)-(l) Tail.图2 根腐线虫JZ-257种群雌虫形态Fig.2 Female morphology of Pratylenchus JZ-257 population

表1 鹤壁HB-1种群和焦作JZ-257种群雌虫形态测量值
Table 1 Morphological measurements of females in Hebi HB-1 population and Jiaozuo JZ-257 populatio

形态测量值Morphometric valueHB-1种群HB-1populationRoman &Hirschmann(1969)JZ-257种群JZ-257populationLoof(1960)体长/μmBody length434.5±31.3(406.0～538.1)504.4±23.0(436.8～553.2)434.3±41.6(384.5～526.5)430.0(330.0～490.0)体长/最大体宽Body length/Greatest body width24.7±2.3(20.3～28.2)26.3±1.6(21.4～29.0)23.2±1.8(20.6～26.6)22.5(20.5～26.4)

表1(续)

形态测量值Morphometric valueHB-1种群HB-1 populationRoman &Hirschmann(1969)JZ-257种群JZ-257populationLoof(1960)体长/体前端至食道与肠连接处Body length/Length from the lips to thejunction of esophageal gland and intestine5.3±0.5(4.5～6.2)6.3±0.3(5.7～7.0)5.6±0.7(4.3～6.7)6.0(5.7～6.1)体长/体前端至食道腺末端的距离Body length/Length from the lips toesophageal gland end4.0±0.2(3.4～4.5)4.2±0.4(3.5～5.0)体长/尾长Body length/Tail18.9±1.6(16.7～22.2)18.4±0.8(16.9～20.6)18.4±1.5(16.0～21.3)20.5(17.7～22.9)尾长/肛门处体宽Tail length/Tail diameter at anus2.3±0.4(1.1～2.7)2.1±0.2(1.9～2.7)体前端至阴门的距离×100/体长Distance of vulva from the lips×100/Body length79.3±1.4(79.3～83.6)77.4±1.2(75.0～82.0)81.0±1.6(79.0～83.5)83.0(82.0～84.0)尾长/μmTail length23.1±1.7(24.3～26.7)27.3±1.6(24.0～30.6)23.7±2.7(20.5～28.0)阴门与肛门的距离/μmDistance from vulva to anus66.8±8.9(59.8～91.9)84.2±7.6(57.6～100.4)59.5±8.6(45.0～74.0)口针长/μmStylet length15.0±0.8(14.1～17.1)15.0±0.4(14.4～16.8)15.2±1.0(14.2～17.0)16.0～17.0杆部长/μmMetenchium length7.2±0.6(7.0～8.5)7.6±0.6(6.9～9.0)背食道腺开口到口针基部球的距离/μmDistance between dorsal esophageal gland opening and stylet knobs2.5±0.4(1.9～3.1)2.2±0.3(1.8～2.6)2.3±0.5(1.8～3.3)排泄孔至体前端距离/μmLength from anterior end to excretory pore75.2±2.5(74.0～82.0)80.9±3.1(74.0～86.0)75.7±4.3(71.3～80.3)体前端至食道腺末端距离/μmPharynx length108.2±6.4(101.8～114.6)103.9±4.4(96.9～110.5)食道腺覆盖长度/μmPharyngeal overlap26.0±5.3(19.0～38.9)26.1±3.9(21.4～34.1)后阴子宫囊长度/μmPost-vulval sac length22.4±2.0(18.6～26.9)18.1±2.2(15.8～22.2)侧区宽/μmLateral field width5.9±0.7(6.1～7.3)5.6±0.8(4.9～6.1)尾环数/个No. of tail annuli20.0±1.4(17.0～23.0)20.0±1.1(18.6～21.4)

注：数据均为测量值的平均值±标准差(最小值～最大值)。HB-1和JZ-257测量样本数量分别为16和13个。
Note: Values represent the mean of measurement±standard deviation (minimum value～maximum value). The number of HB-1 and JZ-257 specimens was 16 and 13, respectively.

2

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1

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1

HB-1种群的形态特征

1)雌虫特征(图1)：雌虫短粗呈圆筒状，经高温热杀死后虫体僵直且略向腹面弯曲(图1(a)和(i))。头架骨化明显；唇区低平稍溢缩(图1(b))，两唇环宽度近乎相等；口针强壮，长14.1～17.1 μm，口针基部球圆，前缘凹陷(图1(f)～(h))；背食道腺开口距口针基部球1.9～3.1 μm；中食道球卵圆形，宽约占该处体宽的2/3；排泄孔位于中食道球与食道腺末端近居中部位，与阴门同侧；食道腺覆盖肠侧腹面(图1(c))；侧区有4条侧线(图1(e))；阴门横裂，与肛门的距离约为尾长的3倍；后阴子宫囊长，未见其分化(图1(d))；尾部末端宽圆，尾环明显(图1(j)～(m))。

2)雄虫未见。

2

.

1

.

2

JZ-257种群的形态特征

1)雌虫特征(图2)：虫体粗壮较短，热杀死后略向腹弯(图2(a)和(m))。唇区较低，明显溢缩(图2(b))；头架骨化不明显；口针发达，中等长度，约14.2～17.0 μm；口针基部球宽，表面略凹(图2(c)和(d))；背食道腺开口距口针基部大约1.8～3.3 μm；中食道球发达呈椭圆形，直径占该处体宽的一半；食道腺覆盖肠前端较长；排泄孔位于食道腺与肠连接处的前端(图2(g))；侧区有4条侧线(图2(h))；卵母细胞单行排列(图2(i))；后阴子宫囊短且长度不等，无明显分化(图2(e))；尾部光滑无纹，形态多变化，通常宽圆，偶呈平截状或指状，略向腹面弯曲(图2(j)～(l))；尾环18～22个。

2)雄虫未见。

2.2 分子生物学鉴定结果及系统进化分析

2

.

2

.

1

分子生物学鉴定结果

1)rDNA 28S D2-D3区序列分析。

使用线虫28S通用引物对供试HB-1和JZ-257种群的rDNA 28S D2-D3区序列进行扩增，经测序后获得2条长度分别为785和781 bp的序列(图3)。将这2个序列在NCBI上进行BLAST比对，发现HB-1种群的rDNA 28S D2-D3区序列(MW487237)与斯克里布纳短体线虫多个种群(MT586733、JX047002和MG906747)的序列相似性较高，均为99.87%；JZ-257种群的rDNA 28S D2-D3区序列(MW487243)与落选短体线虫种群(MT584828)的序列相似性为100%。

M:DL 2 000 marker;1:rDNA 28S D2-D3区;2:rDNA-ITS区。M: DL 2 000 marker; 1: rDNA 28S D2-D3 region; 2: rDNA-ITS region.图3 HB-1(a)和JZ-257(b)种群的PCR扩增Fig.3 PCR results of HB-1 (a) and JZ-257 (b) populations

2)rDNA-ITS区序列分析。

使用线虫ITS通用引物对供试HB-1和JZ-257种群的rDNA-ITS区序列进行扩增，经测序拼接后得到2条长度分别为1 107 bp和906 bp的序列(图3)。将序列在NCBI上进行BLAST比对发现，HB-1种群的rDNA-ITS区序列(MW487240)与斯克里布纳短体线虫种群(MH729053和MT586755)的序列相似性最高，分别为98.74%和98.47%；JZ-257种群的rDNA-ITS区序列(MW487247)与落选短体线虫种群(FR692298和FR692293)的序列相似性最高，分别为96.25%和96.04%。

2

.

2

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2

种群系统进化分析基于HB-1和JZ-257种群的rDNA 28S D2-D3区和rDNA-ITS区序列，以细尖潜根线虫(

Hirschmanniella

mucronata

)为外群，构建了多种根腐线虫的系统进化树。进化树结果表明：HB-1线虫种群和JZ-257线虫种群分别与

P.

scribneri

和

P.

neglectus

聚在同一支(图4和图5)。

本研究获得序列加“▲”标记，超过50%的后验概率显示在相应的分支上。下同。Newly acquired sequence with “▲” marker, with a posterior probability of more than 50% displayed on the corresponding branch.The same below.图4 基于rDNA 28S D2-D3区序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on sequence of D2-D3 region of rDNA 28S

图5 基于rDNA-ITS区序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS sequence

3 讨论与结论

本研究对豫北地区鹤壁和焦作2市玉米根际分离到的2个根腐线虫种群进行了形态和分子鉴定。通过形态测量值比较，发现这2个种群的主要形态特征均与之前的研究报道结果基本一致，仅个别数据存在差异。其中HB-1种群的测量值与Roman等对斯克里布纳短体线虫的描述相比，体长、肛阴门距离及排泄孔至体前端距离较短；JZ-257种群的测量值与Loof对落选短体线虫的描述基本一致。结合分子生物学分析，rDNA 28S D2-D3区序列构建的进化树显示：鹤壁HB-1种群与其它斯克里布纳短体线虫种群聚在1个分支，焦作JZ-257种群与落选短体线虫各种群群体成员聚在1个分支，置信度达到100%；rDNA-ITS区序列构建的进化树显示:鹤壁HB-1种群与河南许昌的斯克里布纳短体线虫种群(MH729053)聚类在1个单独的小支上，两者的亲缘关系相比国内的其它3个种群更近，焦作JZ-257种群与不同地区落选短体线虫4个种群间序列相似度相对较低，可能是由于短体线虫不同地理种群之间的差异或种内变异所致。

土壤样品中植物寄生线虫的数量庞大，很难明确每1条短体线虫的种类，而且短体属线虫外表形态特征大多非常相似，从土壤中分离到的每条短体线虫只能通过肉眼识别挑取，然后进行后续的鉴定工作，将土壤中分离到的所有短体线虫全部进行鉴定的操作性不强且工作量巨大。本研究从2市分离的样本中分别随机挑取了8条根腐线虫雌虫进行单雌纯化培养，最终得到4个纯化的鹤壁种群和5个纯化的焦作种群，同一地市纯化种群的分子鉴定结果一致，即鹤壁HB-1种群均为斯克里布纳短体线虫，焦作JZ-257种群均为落选短体线虫。夏艳辉等在豫东地区商丘市的玉米根际发现咖啡短体线虫和斯克里布纳短体线虫2种根腐线虫复合侵染的现象，而本研究并未发现多种根腐线虫复合侵染的现象。

植物寄生线虫种类多样且分布广泛，是危害农作物的重要病原物之一。据统计，全世界约有50多万种线虫类群，植物寄生线虫占其中的1/10左右。国内外报道较多的有根结线虫(

Meloidogyne

)、孢囊线虫(

Heterodera

)、矮化线虫(

Tylenchorhynchus

)、松材线虫(

Bursaphelenchus

xylophilus

)、螺旋线虫(

Helicotylenchus

)、滑刃线虫(

Aphelenchoides

)和根腐线虫等。根腐线虫的危害程度仅次于根结线虫和孢囊线虫，是1种专性内寄生线虫，该属线虫寄主广泛，国内外均有根腐线虫寄生危害玉米的研究报道。巴西的玉米短体线虫和短尾短体线虫(

P.

brachyurus

)对玉米上的危害十分普遍；在加拿大的爱德华王子岛省发现有刻痕短体线虫(

P.

crenatus

)和穿刺短体线虫在玉米上寄生危害，这2种短体线虫对后期轮作作物的生长发育有显著影响；美国的爱荷华洲玉米种植区有斯克里布纳短体线虫和落选短体线虫侵染危害的报道；此外，一些欧洲国家也有多种根腐线虫侵染危害玉米的研究报道。我国江苏、辽宁、山东、内蒙古、河南和河北等多个省区均有根腐线虫寄生危害玉米的研究报道。本研究对豫北地区鹤壁和焦作2市玉米田中分离到的2个根腐线虫种群进行了种类鉴定，通过形态特征和分子数据明确了供试HB-1和JZ-257种群分别为斯克里布纳短体线虫和落选短体线虫。该研究结果为豫北地区根腐线虫的发生分布、根腐线虫的识别与防控提供了一定的科学依据。