新型H3N8亚型禽流感病毒分离鉴定与鸡致病性研究

孙洪磊 佟 琪 李 涵 韩琪祺 刘激雨 李佳琪 杨吉喆 刘金华

(中国农业大学 动物医学院，北京 100193)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)属于正黏病毒科A型流感病毒属，根据表糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性划分为16种HA亚型、9种NA亚型。野生水禽是流感病毒的自然宿主，通常携带病毒但一般情况不引起发病。当野禽与家禽接触时，可能将自然携带的病毒传播给家禽，部分病毒对鸡等陆生家禽逐步适应，形成稳定流行，并引起家禽发病。目前，家禽禽流感已经成为危害家禽养殖业健康发展最为重要的传染病。临床上，根据病毒对鸡的致病性，分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。其中H5NX和H7N9亚型高致病性禽流感在我国家禽中时有发生，H9N2亚型是最为常见的低致病性禽流感，在肉鸡群、产蛋鸡群多发。虽然低致病性禽流感不会直接造成鸡群高死亡率，但发病禽饲养周期延长、料肉比升高，特别是因病毒感染而造成抵抗力下降，容易发生细菌继发感染而造成死亡，进而导致严重的经济损失。

本实验室临床调查发现，自2021年12月，我国广东、福建、江苏、安徽、河南等地区鸡群中出现一种以眼睑急性肿胀、出血、伴有呼吸道症状，产蛋鸡急性产蛋下降为特征的传染性疾病。为确定引起临床鸡群发病的病原，通过对发病鸡群流行病学调查、病原分离鉴定，诊断为一种新基因型H3N8亚型禽流感病毒。将分离毒株进行了SPF鸡回归试验，评价了该新型H3N8病毒对鸡的感染性和致病性，以期为该病的科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病毒分离与鉴定

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病料采集与处理

2021—2022年对广东、福建、江西、安徽、浙江、安徽、河南、河北、山东和辽宁等家禽养殖大省开展禽流感病毒监测。对临床表现呼吸道症状、产蛋下降等典型流感发病特征的发病鸡采集口咽拭子，死亡鸡剖检取气管、肺脏等组织样品，置于含1 mL无菌PBS(含抗生素)的离心管中，低温运送至中国农业大学农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室进行病毒分离与鉴定。拭子样品涡旋震荡混匀，组织样品加入无菌钢珠研磨混匀，低速离心取上清备用。

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病原核酸鉴定

取口咽拭子重悬液或组织样品研磨液200 μL，RNA提取试剂盒提取核酸，随机引物oligo反转录，实时荧光定量RT-PCR方法分别检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、A型流感病毒以及H5NX、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒。

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禽流感病毒分离鉴定

实时荧光定量RT-PCR检测流感病毒阳性样品接种9日龄SPF鸡胚，35 ℃孵育48 h，4 ℃过夜后收取尿囊液，通过血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验检测流感病毒的HA亚型；一步法提取尿囊液RNA，以流感病毒通用引物unit12反转录为cDNA，霍夫曼引物进行病毒全基因组测序。

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基因遗传进化分析

将毒株全基因序列在GISAID数据库进行Blast序列比对，将各基因片段参考相关序列，使用MEGA11软件绘制邻近法基因进化树，设置1 000次bootstrap重复。

1.2 SPF鸡回归实验

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试验设计

将病毒以10EID/0.2 mL的剂量滴鼻攻毒8只鸡，24 h后将5只同居鸡放入隔离器中共同饲养，每日观察临床症状。攻毒后4 d剖检3只攻毒鸡，观察病理变化，取脏器进行病理组织学检测和病毒滴度测定。攻毒、同居鸡于攻毒后2、4、6、8、10、12和14 d采集口咽拭子和泄殖腔拭子，进行病毒滴度测定。第14天采集鸡血，HI试验检测血清转阳情况。

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组织病理切片及免疫组化

剖检鸡取鼻甲、气管、肺脏、哈德氏腺等组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，制作石蜡切片，进行HE染色、免疫组化染色。免疫组化一抗为禽流感病毒NP抗体。

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扫描电镜样本处理及观察

取气管组织，加入1%的锇酸固定1 h，弃固定液，缓冲液反复漂洗5次，每次15 min。梯度乙醇脱水(50%、70%、90%和100%)3次，每次15 min，乙酸异戊酯置换2次。将置换后的组织取出放于滤纸上，待部分液体吸收，剪取适当大小滤纸放于样品干燥笼内，并进行标记。光学显微镜下将大块组织分离成不规则断面的组织小块，选取需要观察的断面，用导电胶粘合于样本观察板上，真空喷镀金膜后置于扫描电子显微镜下观察。

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病毒载量测定

口咽拭子、泄殖腔拭子加入1 mL含抗生素的无菌PBS，涡旋振荡后低速离心，取上清液进行10倍梯度稀释备用。取鼻甲、气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、十二指肠、胸腺、法氏囊和哈德氏腺，按照0.1 g/mL加入无菌PBS(含抗生素)，组织匀浆机中充分研磨，低速离心，取上清液进行10倍梯度倍比稀释，将原液和不同稀释度样品以0.2 mL/胚接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，接种后于35 ℃孵育48 h，4 ℃过夜后收取鸡胚尿囊液测定血凝效价，按Reed-Muench法计算病毒滴度。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查

自2021年12月首先在广东省某三黄鸡群发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状为典型发病特征的传染性疾病，随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份三黄鸡、麻鸡等有色羽肉鸡群中发生类似疫病，发病鸡群多为30日龄以上的三黄鸡或麻鸡等有色羽肉鸡。2022年3月之后，在河北、河南等地区蛋鸡群出现眼睑肿胀，急性产蛋下降为特征的疫病。该病传播迅速，同一养殖场内鸡群一周以内均出现发病症状。发病鸡典型症状为眼结膜肿胀、出血，张口呼吸，有呼吸啰音(图1(a)～(c))；产蛋鸡产蛋率由90%以上急剧下降到30%以下，且蛋壳质量差(图1(d))。剖检可见气管黏膜出血，有黏液或干酪样渗出物(图1(e))，肺脏淤血实变(图1(f))，哈德氏腺肿胀出血，部分鸡出现心包炎、肝周炎等细菌继发感染症状。鸡群死亡率1%～10%，与饲养管理及继发感染密切相关。多数发病鸡群前期曾进行高致病性禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N6 H5-Re13株+H5N8 H5-Re14株+H7N9 H7-Re4株)以及H9N2灭活疫苗免疫，且鸡群抗体水平>6 log2，表明常规禽流感疫苗免疫达标。

(a)(b)(c)鸡眼睑肿胀；(d)软壳蛋；(e)气管内大量黏液；(f)肺脏淤血(a) (b) (c) Eyelid swelling； (d) Soft-shelled eggs; (e) Mucus attached to trachea; (f) Pulmonary congestion 图1 临床发病鸡典型表现及剖检病变Fig.1 Typical clinical and pathological changes of diseased chickens

2.2 新型H3N8病毒分离及鉴定

对收集到的典型发病鸡场送检样品进行RT-PCR鉴定，检测样品中有15份为A型流感病毒通用引物检测阳性，而NDV、IBV、H5NX、H7N9和H9N2引物检测结果均为阴性。阳性样品接种SPF鸡胚收获的尿囊液进行血凝试验，血凝效价均达到1∶64及以上，HI结果显示该血凝特性可以被H3亚型AIV血清抑制，不能被H5、H7、H9亚型AIV和NDV血清抑制。将全基因测序结果进行Blast分析，15株病毒均为H3N8亚型。基因序列上传至GISAID，序列号：EPI_ISL_12951098、12950567、12950247、12949914、12949277、12947104、12946882、12946278、12945954、12945655、12945224、12944913、12944402、12943865和12935439。

2.3 基因遗传进化分析

对分离的H3N8病毒基因进化分析显示，病毒

HA

和

NA

基因均形成独立进化分支，

HA

基因属于欧亚禽分支，与2018年分离自广东的鸭源H3N8病毒A/duck/Guangdong/F1172/2018(H3N2)相似性为96%(图2)；

NA

属于北美禽分支，与2020年分离自俄罗斯库页岛野鸟中的病毒A/common teal/Sakhalin/66c/2020(H3N8)相似性为97%(图2)。6个内部基因均来源于中国鸡群中优势流行的G57基因型H9N2亚型病毒，值得注意的是H3N8病毒的内部基因分属于不同进化分支(图2)，表明病毒在流行过程中可能存在动态重排。

本研究分离毒株为蓝色，用于鸡致病性试验的毒株标记星号，人源H3N8毒株为斜体标记。The H3N8 viruses isolated in the present study are indicated in blue. The viruses used in chicken experiment are marked with asterisk. The human H3N8 viruses are marked as italic.图2 H3N8亚型禽流感病毒基因进化树Fig.2 Phylogenetic tree of H3N8 AIVs

所有H3N8病毒的

HA

裂解位点均为PEKQTR/GLF，无多碱性裂解位点插入。

2.4 新型H3N8病毒对SPF鸡致病性

选择A/chicken/Guangdong/F0103/2022(GD/F0103)、A/chicken/Henan/F0316/2022(HN/F0316)和A/chcken/Anhui/FE12/2022(AH/FE12)三株H3N8病毒进行SPF鸡致病性试验。14 d观察期内所有3株病毒的攻毒鸡及同居鸡均未出现死亡。感染后3 d，部分攻毒鸡、同居鸡表现出张口呼吸、炸毛、缩颈、采食量下降等症状，攻毒10 d后鸡只精神状态转为正常。部分攻毒鸡及同居鸡出现眼睛肿胀、出血病变(图3(a)和(b))，该症状一直持续至试验结束。

(a)(b)眼睑肿胀；(c)哈德氏腺出血；(d)胸腺出血；(e)盲肠扁桃体肿胀出血；(f)肾脏肿胀(a) (b) Eyelid swelling; (c) Harderian gland hemorrhage; (d) Thymic hemorrhage; (e) Cecal tonsil hemorrhage; (f) Kidney swelling图3 H3N8病毒感染鸡典型临床表现及剖检病变Fig.3 Gross lesions in SPF chickens inoculated with the H3N8 AIVs

攻毒后4 d每组取3只攻毒鸡进行剖检，可见眼睛红肿、哈德氏腺出血(图3(c))；鼻甲内有黏液渗出，气管黏膜潮红，有渗出物附着，肺脏轻微淤血；胸腺、盲肠扁桃体出血(图3(d)和(e))，肾脏肿大(图3(f))。病理组织学观察可见眼结膜上皮细胞坏死脱落，黏膜下层淋巴组织急性增生(图4(a))；鼻甲黏膜下层淋巴组织增生，大量炎性细胞浸润，毛细血管扩张充血，部分区域出血(图4(c))；气管纤毛上皮细胞坏死脱落，黏膜下层炎性细胞浸润，血管充血(图4(e))；肺脏终末细支气管周围大量炎性细胞浸润，伴有充血出血，导致部分肺房实变(图4(g))。免疫组化原位检测可见：哈德氏腺黏膜层细胞(图4(b))、鼻甲腺体上皮细胞(图4(d))，气管纤毛上皮细胞(图4(f))，肺脏终末细支气管上皮细胞(图4(h))有大量流感病毒抗原阳性信号。扫描电镜观察气管黏膜层病变，可见H3N8病毒感染鸡气管纤毛上皮细胞坏死崩解，纤毛大量脱落(图5)。

左侧为HE染色,(a)(c)(g)放大倍数为100×，(e)放大倍数为200×。右侧为免疫组化染色,放大倍数为400×。(a)哈德氏腺肿胀出血，淋巴小结增生；(b)哈德氏腺黏膜层细胞阳性；(c)鼻甲黏膜下层炎性细胞浸润；(d)鼻甲腺体细胞阳性；(e)气管上皮细胞坏死脱落；(f)气管上皮细胞阳性；(g)肺脏实变；(h)肺脏终末细支气管上皮细胞阳性。Left is HE staining. Magnification of (a) (c) (g) is 100× and (e) is 200×. Right is immunohistochemical staining and magnification is 400×. (a) H3N8 virus infection causes Harderian gland swelling and inflammatory changes; (b) Extensive influenza viral NP distribution in the Harderian gland; (c) Infiltration of inflammatory cells in submucosa of turbinate； (d) Extensive influenza viral NP distribution in the turbinate epithelial cells (e)Necrosis of tracheal epithelial cells; (f) Extensive influenza viral NP distribution in the tracheal epithelial cells (g) Severe interstitial pneumonia and bronchopneumonia; (h) Extensive influenza viral NP distribution in the lung epithelial cells.图4 H3N8病毒感染SPF鸡引起的病理组织学变化Fig.4 Histopathological changes of SPF chickens inoculated with the H3N8 AIVs

(a)正常对照鸡气管；(b)H3N8病毒感染鸡气管(a) Trachea of mock infection chicken; (b) Trachea of the H3N8 virus infection chicken图5 H3N8病毒感染SPF鸡气管扫描电镜观察Fig.5 Scanning electron microscope observation for trachea of SPF chicken inoculated with the H3N8 AIVs

2.5 新型H3N8病毒对SPF鸡的感染性及传播性

3株H3N8病毒的攻毒组和同居组鸡口咽拭子和泄殖腔拭子中均检测到排毒，口咽的排毒量显著高于泄殖腔，排毒期最长为8 d,攻毒组排毒高峰在2～4 d,同居组排毒高峰在4～6 d(图6)。攻毒后14 d，所有攻毒鸡、同居鸡均出现抗体转阳。表明H3N8病毒对鸡高度适应，主要通过口咽排毒，在鸡群中可以高效传播。

口咽拭子样品标记为红色，泄殖腔拭子样品标记为绿色，与X轴平行的虚线代表最低病毒检出量，攻毒与同居鸡样品由与Y轴平行的虚线分隔。Red represents oropharyngeal samples, green represents cloacal samples, dashed lines parallel to X axis indicate the lower limit of virus detection, dashed lines parallel to Y axis separate inoculated and contacted groups of each virus.图6 H3N8病毒对鸡的感染性及传播性Fig.6 Replication and transmission of the H3N8 AIVs in SPF chickens

脏器病毒定量结果显示(图7)，3株病毒均可以在鸡的呼吸系统高效复制，鼻甲、气管和肺脏中均可以检测到较高的病毒滴度，肺外脏器中哈德氏腺病毒含量最高，脾脏等脏器检测到较低的病毒滴度。3株 H3N8分离株对鸡的致病性存在一定的差异，其中HN/F0316毒株在组织脏器中的分布最广泛，除呼吸系统和哈德氏腺含毒量较高之外，在脾脏、肾脏、脑、胸腺、法氏囊和十二指肠均检测到病毒(图7(c))，说明此毒株具有较广的组织亲嗜性，感染与复制能力较强。

与X轴平行的虚线代表最低病毒检出量。Dashed lines parallel to X axis indicate the lower limit of virus detection.图7 H3N8病毒攻毒鸡脏器病毒分布及载量Fig.7 Virus distribution and titration of H3N8 AIVs in SPF chicken organs

3 讨 论

本研究通过对发病鸡群疫病监测，在我国鸡群中发现一种具有致病性的新型H3N8病毒。这种新型禽流感病毒由欧亚分支H3基因、北美分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因三源重排组成。通过对临床病例的流行病学调查以及病毒对SPF鸡进行致病、传播性研究，结果显示这种新型三源重排H3N8亚型禽流感病毒对鸡高度适应，可在鸡上呼吸道高水平复制、排毒，在鸡群中高效传播，造成鸡呼吸系统损伤，可引起结膜炎特征性病变。

H3亚型AIV是我国流行最为广泛的AIV亚型，以往流行病学调查显示，H3亚型病毒主要流行于野生禽类或家鸭中，但多数为无症状带毒，很少有H3亚型病毒引起禽类发病的报道，鸡群携带H3亚型病毒的报道较少，多为活禽市场鸡体污染携带。表明之前流行的H3亚型AIV主要存在于水禽这一流感病毒自然宿主库中，对鸡等陆生家禽尚未很好适应。本研究发现，新型鸡源H3N8病毒不仅能在鸡呼吸系统高效复制、排毒，而且可高效传播给同居鸡，造成病毒在鸡群间的快速流行扩散。新型H3N8病毒虽然HA蛋白裂解位点未有多碱性氨基酸插入，但其致病性相比于早期水禽源H3病毒明显提升，对呼吸系统黏膜造成严重损伤，为细菌、支原体继发感染提供条件。特别值得注意的是该病毒可造成眼结膜损伤，这一特征性病变可作为临床诊断的标准之一。本研究分离到的H3N8病毒多数来源于三黄鸡、麻鸡等有色羽肉鸡，有色羽肉鸡的饲养模式多为开放式或半开放式，这种养殖模式的鸡与其他家禽或者野生禽类的接触频繁，同时，开放式养殖模式使得鸡场的生物安全防护更难执行，这为新型流感病毒的流行扩散提供了条件。

相比于早期流行的水禽源H3N8病毒，含有H9N2病毒内部基因的新型H3N8病毒对鸡致病性增强，表明获得了H9N2病毒的内部基因是导致其对鸡感染、致病力增强的主要原因。研究表明，2010年之后流行的G57基因型H9N2病毒对鸡的复制、致病性均显著高于早期流行毒株，尤其是2015年之后流行的G57基因型变异性H9N2病毒，不仅引起鸡气管栓塞、肺脏实变等严重呼吸道症状，而且造成肾脏等肺外多脏器损伤。其中G1-like

M

基因对于促进病毒在鸡体内高效复制具有重要贡献作用；vRNP复合体基因的变异导致的聚合酶活性提升也是致病性增强的重要机制之一。因此，新型H3N8病毒直接获得了H9N2病毒的内部基因利于其快速适应鸡群，而且现有禽流感疫苗免疫抗体对H3亚型病毒均无交叉保护效果，这也利于新型H3N8病毒的快速传播。

自2013年H7N9流感病毒出现以来，陆续出现H5N6、H7N4、H10N8、H10N3以及H3N8亚型感染人的新型AIV。值得关注的是，这些病毒的内部基因均为H9N2来源，表明H9N2已成为产生新型病毒的“母病毒”。基因分析显示，新型H3N8病毒的表面基因形成独立进化分支，但其内部基因来源于多个分支，表明其在流行过程中存在“动态重排”的特点，这一现象在之前的H7N9和H10N8等病毒中都有发现。这种与H9N2病毒基因库的“动态重排”为病毒适应新环境提供了极大便利，可使新型病毒短时间内快速适应不同区域、不同养殖环境，从而形成流行。目前，我国虽然应用灭活疫苗免疫减轻了鸡群感染H9N2病毒的发病症状，但是由于单纯体液免疫无法有效阻止病毒在鸡上呼吸道的感染，H9N2病毒在免疫鸡群中仍广泛流行。因此，研发可提供上呼吸道局部黏膜免疫的新型禽流感疫苗是防控H9N2病毒的关键措施，也是从根本上控制新型流感病毒产生的关键环节。

特别值得注意的是2022年4月，河南驻马店市一名4岁男孩感染H3N8病毒；随后，2022年5月，湖南长沙市一名5岁男孩感染H3N8病毒。基因分析表明，人源H3N8病毒与鸡源病毒高度同源，表明人感染H3N8病毒是由接触带毒鸡造成的“溢出性”感染。虽然当前H3N8禽流感病毒为零星散发，鉴于H3亚型禽流感病毒曾引起1968年香港流感大流行流感，因此需要高度重视H3N8禽流感病毒的公共卫生威胁。

4 结 论

本研究发现一种新型三源重排H3N8亚型禽流感病毒在我国鸡群中流行，并引起鸡临床发病。新型H3N8禽流感病毒对鸡高度适应，对呼吸系统致病性较强，且具有感染人类风险，对家禽养殖业和公共卫生造成巨大威胁。应尽快开展系统的流行病学监测，及早对病毒的源头及传播途径进行防控，力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。