燕山板栗种皮、种仁的抗氧化性分析

赵玉华，赵丽男，吴家秀，常学东

（1 河北科技师范学院食品科技学院 河北昌黎 066600；2 板栗产业技术教育部工程研究中心；3 河北省板栗产业协同创新中心；4 河北科技师范学院乡村振兴研究中心）

板栗有着“干果之王”的美称，是我国的一种特殊种质资源[1]，它的油脂含量不高但是淀粉含量很高，干板栗的碳水化合物可以达到77%，鲜板栗碳水化合物含量也有40%之多，鲜板栗蛋白质含量为4%～5%[2-3]。板栗的外壳很容易剥落，板栗的口感味甜质糯，是一种很好的烹调食品[4]。

我国板栗栽培历史十分悠久[5]，分布地域辽阔，主要栽培的省份在北方有河北、河南、山东等，南方有湖北、安徽等省份[6]。其中以华北各省板栗产量最多，大约占我国板栗产量的1/5[7-8]。

经过漫长的培育和驯化，已形成了极为丰富的品种资源。根据地区气候、土壤条件、栽培方式、人工选择方向和品种特点等因素，可以把我国的板栗品种划分为5 个地方品种群：华北品种群，长江流域品种群，西北品种群，东南品种群和西南品种群[9]。其中华北地区的板栗具有风味独特，涩皮易剥落等特点，是我国出口创汇的重要农产品[10]。

板栗又被称为“肾之果”，具有强筋健骨、美容养颜的作用[2，6]，其抗氧化能力正在逐步展开研究。酚类和酮类是研究较多的抗氧化物质，国外对食品中多酚类化合物的测定方法的研究开展相对较早，常用的测定方法有ABTS（2-2 连氮-3-乙苯-二噻唑-6 硫酸）测定法[11-12]、DPPH（2，2-联苯-1-三硝基苯肼）测定法[13]、弗雷米自由基还原法[14-15]和FRAP 法（Fe3+还原法）[16]。近几年发展的新方法主要有HPLC（高效液相色谱）、GC（气相色谱）、FC（Folin Ciocalteu）比色法、循环伏安法[17]等。其中色谱法还衍生出了许多与其他仪器（质谱、紫外）联用的新技术，如：GC-MS（气质联用）、LC-MS（液质联用）、GC-MS-SIM（气相色谱-质谱-选择离子监测）、HPLC-UV（紫外探测反相高效液相色谱法）、HPLC-DAD（高效液相色谱-二极管阵列检测器联用仪）法等[18]。

黄酮类化合物主要是由植物光合作用产生的，它的结构母核是以C6-C3-C6为骨架的2-苯基色原酮。目前已知的此类化合物达2000 余种，有黄酮类和类黄酮类，还包括（异）黄烷酮、黄酮醇、黄烷酮醇、双黄酮及其衍生物。结构决定性质，所以我们在研究黄酮类化合物的性质时就需要对其结构进行鉴定[19]。DPPH为有机溶剂中的稳定自由基，其乙醇溶液为深紫色，具有单一电子，能够接受一个电子或是氢离子，在波长为517 nm 下具有最大的光吸收。自由基清除剂存在的情况下，DPPH 的单电子被捕捉使其颜色较淡，在最大光吸收波长处的吸光值下降并呈线性关系，故可利用紫外-可见分光光度仪对DPPH 自由基的捕获情况进行检测，以评价测试样品的抗氧化能力[20]。

近年来，国内外有关酚类物质的研究多集中于苹果、葡萄等树种[21-22]，而对板栗各个部位抗氧化性分析比较的研究相对较少。本文以燕山板栗为研究对象，采用DPPH 法对其外种皮、内种皮、种仁部位的抗氧化活性和抗氧化性物质的含量进行了测定，并对不同部位之间抗氧化活性和抗氧化性物质的含量进行了比较分析，以期为板栗功效的深入研究及产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料 燕山板栗（早丰、燕奎、大板红、燕紫、燕丽、紫珀、遵玉、短枝、燕龙）采购于唐山市迁西县板栗科技示范园，采收后的板栗贮藏于昌黎果树研究所的机械冷库（-2±1 ℃）中。

1.2 仪器和试剂 仪器：分光光度计（VIS-723），上海精密科学仪器有限公司分光仪器总厂；LGJ-18B 型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；电子天平（JA2003 型），上海良平仪器仪表有限公司；电热恒温水浴锅（H.H.S 型），上海医疗器械五厂；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

供试试剂：DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，C18H12N5O6，相对分子质量394.3，纯度90%，Sigma-Aldrich 公司）、无水乙醇、没食子酸、芦丁醇。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 将板栗剥壳，然后将板栗种仁切成片，最后将切成片的种仁和外种皮、内种皮分别冷冻干燥后研磨成粉，备用。

1.3.2 黄酮提取 提取温度为60 ℃，80%乙醇提取1.5 h（浸提3 次），液料比10∶1，8000 r/min 离心得上清液，取1 mL 上清液至10 mL 容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.3 mL，放置6 min，再加10%硝酸铝0.3 mL，放置6 min，再加4% NaOH 4 mL 定容至刻度，摇匀后，510 nm 处测吸光值[23]。以浓度（x）与吸光度（y）进行线性回归得方程：y=9.4165x-0.0088 R2=0.9996[23]。

1.3.3 总酚的提取 准确称取0.5 g板栗样品，用30%乙醇溶液超声提取，液料比为18∶l，超声140 min，超声温度80 ℃[24]。超声冷却后于离心机中8000 r/min离心10 min，取1 mL 提取液于25 mL 容量瓶中，再加4 mL蒸馏水和5 mL酒石酸亚铁溶液，用pH7.5 磷酸盐缓冲液定容至刻度。空白实验：取1 mL 蒸馏水于25 mL 容量瓶中，加4 mL 蒸馏水和5 mL 酒石酸亚铁溶液，用pH7.5 磷酸盐缓冲液定容至刻度。采用分光光度计，540 nm 处测吸光值，计算出标准曲线：y=0.0172x+0.0079 R2=0.9993。酒石酸亚铁溶液配制方法：准确称取1 g 硫酸亚铁和5 g 酒石酸钾钠混合后加蒸馏水溶解定容至1000 mL。pH7.5 磷酸缓冲液的配制方法：称取0.20 g Na2HPO4·12H2O 和5.00 g NaH2PO4·12H2O，混合后加蒸馏水定容至1000 mL[25]。

1.3.4 提取物对DPPH自由基的清除试验 DPPH溶液的配制：准确称取20 mg DPPH自由基，用无水乙醇溶解并定容至250 mL 容量瓶中，摇匀，作为储备液（2.0×10-4mol/L），0～4 ℃避光保存[20]。分别将2.00 mL的各试样提取溶液和2.00 mL DPPH自由基溶液加入到同一具塞试管中，总体积为4.00 mL，混匀，30 min后倒入比色皿中，在517 nm处测量吸光度，测量结果用A1表示。同时测定2.00 mL DPPH 自由基溶液和2.00 mL 无水乙醇混合后的吸光度，测量结果用A0表示；2.00 mL 相同试样溶液和2.00 mL 无水乙醇混合后的吸光度，测量结果用A2表示。根据公式计算抑制率。抗氧化性以抑制率为指标，随着抑制率的增加，其抗氧化能力也随之增强。清除率计算公式：DPPH清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100%[20]。

2 结果与分析

2.1 燕山板栗不同部位抗氧化活性与主要抗氧化性物质的含量 多酚类和黄酮类化合物是板栗体内重要的抗氧化性物质。由表1 可知，板栗中多酚和黄酮含量较高的部位是内种皮和外种皮，且不同种类之间含量也有所不同。9 个板栗品种中，不同部位多酚含量变化范围为5.1～49.5 mg/kg，其中短枝、早丰、遵玉、紫珀、燕紫、燕龙、燕丽、燕奎的内种皮多酚含量较高，大于40 mg/kg，板栗种仁中多酚含量较少，为5 mg/kg左右；黄酮含量范围在13.8～157 mg/kg 之间，其中遵玉、紫珀、燕龙、燕丽、燕奎的内种皮黄酮含量较高在140 mg/kg之上，各个品种果仁中黄酮含量较少，大概是14 mg/kg。

表1 板栗种皮、种仁抗氧化活性与主要抗氧化性物质的含量

不同板栗品种的内种皮抗氧化活性在43%～71%（DPPH 清除率）之间，其中燕龙内种皮、燕紫内种皮、早丰内种皮的抗氧化活性较高，均在68%（DPPH清除率）以上。

在种仁的抗氧化活性比较中，早丰种仁、燕紫种仁、燕龙种仁的抗氧化活性较高，在45%（DPPH 清除率）以上；外种皮的抗氧化活性没有显著性差异，大约1%（DPPH 清除率）。

2.2 燕山板栗外种皮内种皮种仁中多酚、黄酮含量及DPPH 清除率的方差分析 由表2 可知，对所测定的9 个燕山板栗品种外种皮、内种皮、种仁中多酚、黄酮含量及DPPH 清除率的方差分析表明：9 个板栗品种外种皮、内种皮、种仁中多酚和黄酮含量具有显著性差异；在抗氧化活性方面，供试的9 个板栗的外种皮、内种皮、种仁的抗氧化活性（DPPH 清除率）具有显著性差异。

表2 板栗外种皮内种皮、种仁中多酚、黄酮含量及DPPH 清除率的方差分析

2.3 板栗不同部位的DPPH 清除率方差分析 由表3 可知，板栗不同部位的DPPH清除率方差分析表明：燕紫内种皮的DPPH 清除率和燕龙、早丰的差异不显著，燕丽内种皮的DPPH清除率和燕奎的差异不显著，大板红和遵玉内种皮的DPPH 清除率差异不显著，其它品种之间差异显著；燕紫外种皮的DPPH 清除率和燕奎、遵玉的差异不显著，燕龙和大板红内种皮的DPPH清除率差异不显著，早丰和紫珀内种皮的DPPH清除率差异不显著，其它品种之间差异显著；燕紫、燕龙和早丰种仁的DPPH 清除率差异不显著，燕丽、大板红、遵玉的DPPH 清除率差异不显著，燕奎和紫珀DPPH 清除率差异不显著。

表3 板栗种皮、种仁的DPPH 清除率方差分析

2.4 板栗种皮、种仁的黄酮含量方差分析 由表4 可知，板栗种皮、种仁的黄酮含量方差分析表明：燕紫内种皮的黄酮含量和大板红、早丰的内种皮黄酮含量无显著性差异，燕丽、燕奎、遵玉、紫珀内种皮的黄酮含量无显著性差异，短枝、燕紫、燕丽和燕龙的内种皮黄酮含量具有显著性差异；燕紫、燕丽、短枝、早丰的外种皮黄酮含量差异不显著，燕龙和燕奎的外种皮黄酮含量差异不显著，燕龙、遵玉、燕紫、大板红和紫珀外种皮黄酮含量有显著性差异；燕紫、燕龙、燕奎和遵玉种仁的黄酮含量差异不显著，燕丽、大板红、紫珀种仁的黄酮含量差异不显著，燕紫、燕丽、早丰和短枝的种仁黄酮含量有显著性差异。

2.5 板栗种皮、种仁的多酚含量方差分析 由表5 可知，燕紫、燕丽和早丰内种皮的多酚含量差异不显著，燕龙、短枝、遵玉、紫珀内种皮的多酚含量无显著性差异，大板红、燕紫、燕龙和燕奎内种皮的多酚含量有显著性差异；燕紫、燕丽、早丰、遵玉和紫珀外种皮的多酚含量无显著性差异，燕龙、燕奎和短枝外种皮的多酚含量差异不显著；燕紫、燕丽、大板红、遵玉、紫珀种仁的多酚含量差异不显著，燕龙、燕奎、短枝、早丰种仁的多酚含量差异不显著。

3 结论与讨论

通过对板栗样品的DPPH 清除率和多酚、黄酮含量的测定分析，发现同一板栗品种的内外种皮或种仁的DPPH 清除率和多酚、黄酮含量的差异均显著，不同品种板栗内外种皮或种仁的DPPH 清除率和多酚、黄酮含量差异不显著。板栗内种皮和外种皮中多酚和黄酮的含量高，种仁中多酚和黄酮含量较低，内种皮和种仁的DPPH 清除率大，抗氧化活性强，外种皮的DPPH 清除率小，抗氧化活性弱。

对板栗的抗氧化性物质提取及其生物活性的研究进行深入挖掘，开发出具有功能性的食品和饮料，既可以为人类健康作贡献，又可以创造出更大的经济效益，对板栗的发展起到了促进作用，使板栗加工业能更加全面系统。我们在加工处理过程中不仅要把种仁利用起来更要把内外种皮利用起来，发挥板栗内外种皮的食用价值和药用价值。