不同性质土壤中钼的植物毒性及预测模型

高凡，王学东，罗小绒，罗崇义，彭憬

（首都师范大学资源环境与旅游学院，北京 100048）

钼（Mo）是植物、动物和微生物必需的微量元素之一[1]。Mo可以促进植物体内磷的吸收和运输，同时参与氮代谢，在转运碳水化合物的过程中也发挥着重要作用[2]。作为全世界钼矿资源最为丰富的国家，我国探明储量的钼矿区已高达200 多个，其中大中型钼矿床多，分布较为广泛[3]。但是，随着钼矿的加速开采，一些地方土壤出现了Mo 的累积[4]。此外，现代的工业活动，如不锈钢、铸铁、超合金制造，冶金加工，煤炭石油燃烧，磷酸盐肥料的使用和磷酸盐洗涤剂的排放等也使大量Mo 排放于土壤环境中[5]。土壤中过度积累的Mo 不仅破坏生态系统，而且通过食物链直接或间接地危害人体健康，导致人神经异常、智力发育迟缓、骨骼生长抑制等[6]。因此，加强对土壤Mo 污染风险管控对于保护生态系统安全具有重要意义。

Mo在土壤中的迁移累积及风险与其形态密切相关。Mo 在土壤中的形态可分为水溶态钼（溶解于水中的Mo）、有机态钼（存在于有机物质中的Mo）、难溶态钼（被原生矿物和铁铝氧化物固定的Mo）、代换态钼（以MoO2-4和HMoO-4形式被土壤胶体吸附的Mo）4种类型[7-8]。在一定条件下，这4 种形态的Mo 可以相互转化，并且转化过程较为迅速。而随着pH 值的变化，土壤溶液中Mo 的形态往往会发生变化：当pH>4时，主要以MoO2-4为主[9]；当2.5≤pH≤4 时，以HMoO-4、Mo（OH）6和HMo2O-7为主；当pH<2.5时，主要以非离子化的H2MoO4形式存在[10]。土壤中的Mo 对生物的毒性在很大程度上取决于土壤特性及其在土壤中存在形态[11]。

国外较早地开展了Mo 的风险评价研究，如欧盟利用欧洲土壤开展了Mo对无脊椎动物、植物、微生物的毒性试验并获得相应的毒性阈值，意大利、荷兰、法国等国家针对Mo也规定了本国的土壤环境质量标准值。而我国针对Mo 的毒理学研究数据还较少[12]，《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）中也没有涉及Mo 的标准。因此，开展土壤Mo的生态风险评价研究具有重要意义。

我国土壤类型繁杂多样，各地区的土壤性质差异较大，因此污染物在进入土壤之后的迁移转化和生物有效性会因土壤差异而发生变化[13]。基于此，本研究根据我国土壤pH 值和土壤有机质含量等分布规律，选取了9 个不同地区的理化性质差异较大的具有代表性的土壤样品，以大麦作为供试植物，通过外源添加钼酸盐（Mo6+）的方式，研究土壤Mo 对植物的毒性阈值及土壤主控因子，为丰富土壤重金属元素的毒理学数据库，以及开展我国土壤Mo 生态风险评价及建立相关基准提供参考。

1 材料与方法

1.1 土壤采样和处理

在我国土壤理化性质差异较大的9 个地区采集土壤样品，土壤的基本理化性质如表1 所示，其中土壤pH 值变化范围为5.31～8.90，有机碳含量（OC）变化范围为0.6%～2.5%，阳离子交换量（CEC）变化范围为6.36～19.30 cmol·kg-1。土壤样品取自0～20 cm 耕层，经25 ℃风干，过2 mm尼龙筛后储存。

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of the test soils

根据9 个地区土壤的理化性质差异，通过预实验确定Mo 的添加量，其中廊坊、广州土壤添加Mo 的含量为0、50、100、200、400、800、1 600、3 200 mg·kg-1；祁阳、嘉兴、杭州、石家庄、杨凌、郑州、德州土壤添加Mo的含量为0、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 mg·kg-1。通过喷洒不同含量的二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）溶液将Mo 添加到土壤中，整个过程充分拌匀以确保其均匀分布。每个Mo添加处理设置3 个重复。土壤保持100%最大田间持水量平衡2 d后，风干、粉碎，过2 mm尼龙筛后备用。

1.2 土壤理化性质测定

主要测定的土壤理化性质包括pH 值、电导率（EC）、黏粒含量（Clay）、OC、CEC、土壤Mo 的背景值以及铁、铝、锰氧化物含量（Feox、Alox、Mnox）。其中，pH值使用pH 计测定；EC 使用微电极仪测定；Clay 通过沉降法获得；OC 通过高温燃烧法测定的总碳减去Pressure-Calcimeter 法测定的无机碳获得；CEC 通过非缓冲硫脲银法测定；土壤Mo的背景值使用ICP-MS测定；Feox、Alox、Mnox使用电感耦合等离子体质谱仪测定[14]。

1.3 植物毒性测试

植物毒性测试试验参照国际标准组织ISO-11269-1标准方法[15]，以大麦根伸长为评价终点，该方法不仅简单易测，而且广泛应用于欧洲和我国土壤中Cu、Zn和Ni等重金属的毒性研究。称取120 g土样装入聚氯乙烯（PVC）材质的圆柱形培养杯（高12 cm，直径4.2 cm），然后放入人工培养箱中培养7 d，培养条件：白天持续时间14 h，光照条件为25 000 lx·m-2，温度为20 ℃，湿度为70%；夜间持续时间10 h，光照条件为45 W 的钨灯，温度为16 ℃，湿度为70%。在整个培养期，通过添加蒸馏水使土壤保持60%最大田间持水量。土壤培养7 d 后，用双氧水消毒过的大麦种子放置于带有滤纸的培养皿中，添加蒸馏水至没过种子，待培育2 d 胚根根长2 mm 后，以胚根向下的方式将种子播种在离土表1 cm的土壤中。种子培养5 d后，取出大麦，测量其根长。

1.4 数据处理

Mo浓度与大麦根伸长的剂量效应关系采用澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）研发的逻辑斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）拟合[16]，公式如下：

式中：Y是大麦相对根伸长，%；X是lg（土壤总Mo 的含量），土壤总Mo为土壤Mo背景值和外源添加Mo之和；Y0、b是拟合参数；M是lgEC10、lgEC50，其中EC10和EC50表示抑制大麦根伸长10%和50%时土壤总Mo含量。通过该公式可以得到EC10、EC50和相应95%的置信区间。

采用SPSS 26.0 检测所有数据是否满足线性回归，是否满足正态分布，最后进行Pearson 相关性分析和线性回归分析；采用Origin Pro 8.5 绘制剂量-效应曲线和模型验证效果图。

2 结果与讨论

2.1 土壤Mo 对大麦根伸长的毒性阈值和剂量-效应曲线

土壤Mo 对大麦根伸长的毒性阈值和剂量-效应曲线如表2 和图1 所示。由图1 可知，对于所有类型土壤，随着Mo浓度升高，大麦相对根伸长变短，其中，广州土壤（pH=7.27）的Mo 对大麦毒性最大，EC10值为262.64 mg·kg-1，EC50值为851.10 mg·kg-1；石家庄土壤（pH=8.19）的Mo 对大麦毒性最小，EC10值为3 301.70 mg·kg-1，EC50值为5 142.62 mg·kg-1。整体来看，9 个地区EC10的最值相差11.57 倍，而EC50的最值相差仅5.04倍。

图1 Mo对大麦根伸长的剂量-效应曲线Figure 1 Dose-response curves of Mo concentrations for barley root elongation

表2 Mo对大麦根伸长的毒性阈值（mg·kg-1）Table 2 Toxicity thresholds measured by barley roots elongation for Mo（mg·kg-1）

针对本研究选取的9 个地区土壤，以往研究报道了Cu、Ni、Co、Cr 4 种元素的大麦毒性[17-20]，对比结果表明，Mo 的EC10的最值变化大于Cu（5.64 倍）、Cr（6.28 倍），小于Ni（41.11 倍）和Co（105.49 倍）；Mo 的EC50的最值变化大于Cu（6.02 倍）、Cr（4.17 倍），小于Ni（13.62 倍）和Co（36.30 倍）。这表明土壤理化性质对Mo 的毒性有较大影响，因此，探究影响Mo 对大麦毒性的主要土壤理化性质并且基于此建立相关预测模型较为重要。

2.2 土壤Mo对大麦根伸长的影响因子

基于欧洲土壤的研究[21]结果表明，Clay 是影响土壤Mo 对大麦毒害作用最重要的因子，基于Clay、pH和CEC 等土壤因子建立的预测模型可以较为准确地预测Mo对大麦的毒性阈值。国内针对Cu[17]和Zn[22]对大麦毒性的研究发现，基于pH、CEC 和OC 等土壤因子建立的预测模型可以较为准确地预测其对大麦的毒性阈值；此外，针对Cr[20]对大麦毒性的研究发现，pH、Alox和Feox等土壤理化性质均能影响其对大麦的毒害作用。综上所述，土壤pH、OC、Clay、CEC、Feox、Alox和Mnox均可能影响重金属元素的毒害作用。基于此，本研究测定了上述土壤理化性质，并且利用SPSS 26.0 分析了9 个地区土壤的不同理化性质与EC10、EC50的Pearson相关关系，结果如表3所示。

通常P<0.05作为显著性差异的判定标准，但由于统计学中的显著性受抽样误差的影响，实际上P<0.1时即可认为变量在90%的置信水平上具有显著相关性。由表3 可知，土壤CEC 是影响EC10和EC50的主要因子，二者在0.1 水平（P<0.1）上均呈显著的正相关；pH 值和Mnox与EC 值的相关系数较高；而OC、Clay 和Alox等其他土壤因子与EC值的相关系数较低。

表3 土壤理化性质与毒性阈值的Pearson相关系数Table 3 Pearson correlation coefficient between soil physical and chemical properties and toxicity thresholds

大量研究表明，土壤中重金属的生物有效性受土壤理化性质的影响显著。其中，土壤CEC 是重要的影响因素之一[23-24]。本研究发现，CEC 是预测我国土壤中Mo对大麦毒性阈值的最重要的因子，这与COR⁃NELIS 等[25]和KRIS 等[26]研究结果相似，该两项研究利用欧洲土壤分别研究了Mo对土壤无脊椎动物（蚯蚓）和土壤微生物的毒性，结果发现土壤CEC 与蚯蚓以及土壤微生物毒性均具有显著的相关性。但利用我国土壤进行的Cu[27]、Zn[22]和Ni[28]对大麦毒性研究结果却发现，这3 种元素的毒性阈值主要受土壤pH 值的影响，这与Mo 的研究结果不同。可能是因为Cu、Zn和Ni 在土壤中分别以二价阳离子的形式存在，而Mo主要以MoO2-4阴离子的形式存在于土壤中。CEC是用来衡量土壤可交换阳离子的能力的指标，研究表明，土壤中黏土含量、有机物含量和土壤pH 值是影响CEC 的重要因素[29-31]，而黏土和有机物均有钼酸盐的结合位点[32]，多因素的共同作用导致CEC含量较高的土壤中Mo 对植物的生物利用度和毒性降低。另外，本研究表明，当预测模型引入土壤因子Mnox时，对Mo的毒害阈值预测能力增强，这可能是因为土壤中的Mnox表面有较多的活性基团，如OH-、OH2+、OH3+等基团，对很多有机和无机阴离子有较强的吸附作用[33]，所以向土壤中加入钼酸盐时，MoO2-4可以扩散到Mnox的孔隙中，优先与多配位基的配合物结合，从而降低了土壤中Mo对植物的毒性。

2.3 土壤Mo对大麦毒性阈值的预测模型

为了量化表征土壤因子与Mo的毒性阈值之间的关系，通过一元和多元线性回归分析，拟合基于土壤因子的Mo 对大麦毒性阈值的预测模型，如表4 所示。结果表明当只考虑CEC 对EC10、EC50值的影响时（方程1、方程4），可以分别解释36.6%、34.0%的变异；当将pH 值作为第2 个土壤因子纳入模型时（方程2、方程5），预测能力显著提高，可以分别解释66.8%、68.1%的变异（P<0.05）；当模型中纳入第3 个土壤因子Mnox含量时（方程3、方程6），模型变异系数提高至82.2%、88.5%（P<0.05）。但是，当模型中纳入第4 个甚至更多的土壤因子时，预测能力并没有得到改善。因次，本研究将包含CEC、pH 值和Mnox含量3 个土壤因子的预测模型（方程3、方程6）作为风险评价的最终结果（P<0.05）。

表4 基于土壤因子的Mo毒性阈值的预测模型Table 4 Prediction models of Mo toxicity threshold based on soil factors

使用基于土壤因子的Mo 毒性阈值预测模型（方程3、方程6）可以得到9 个地区土壤EC10、EC50的预测值。将预测值与实测值（对数转化）进行作差比较（图2），结果表明，两者的误差均小于0.5 个数量级，误差较小，表明该模型可以较为准确地预测我国典型土壤Mo对大麦的毒性。

图2 毒性阈值的预测值和实测值的关系Figure 2 The relationships between measured and predicted toxicity thresholds

为了进一步验证预测模型的准确性，本研究比较基于欧洲土壤研究得到的Mo 对大麦的毒性阈值[21]（表5）与模型的预测数据。该研究表明，与EC10值相比，EC50值具有较小的置信区间，并且受实验误差的影响较小，所以本研究只验证了与土壤理化性质相关性更好的EC50值。使用基于土壤因子对Mo毒性阈值的预测模型（方程6）可以得到欧洲9 个地区土壤EC50的预测值，与实测值（对数转化）进行作差比较（图3a）。结果表明，两者的误差有1/3小于0.5个数量级，2/3 大于0.5 个数量级，误差较大，说明基于我国土壤建立的Mo对大麦的毒性阈值的预测模型不适用于欧洲土壤。这是因为我国土壤的CEC 在6.36～19.30cmol·kg-1之间，最大值和最小值相差约2 倍，而欧洲土壤的CEC在4.1～41.7 cmol·kg-1之间，最大值和最小值相差约9 倍，欧洲土壤的CEC 范围远超我国土壤，不符合模型的应用条件。

图3 EC50的预测值和实测值的关系Figure 3 The relationships between measured and predicted EC50 values

表5 欧洲土壤中Mo对大麦根伸长的EC50值（mg·kg-1）[21]Table 5 EC50 values measured by barley roots elongation for Mo in European soils（mg·kg-1）[21]

为了建立适用土壤范围更为广泛的阈值预测模型，对我国和欧洲共18 个地区土壤的理化性质和毒性阈值进行相关性分析，结果发现土壤中影响EC50值的主要因子仍是CEC（P<0.01），并且当模型引入pH值和Mnox含量两个土壤因子时，模型变异系数由75.1%提升至97.7%（P<0.01）。使用重新得到的预测模 型（lgEC50=1.466lgCEC+0.134pH+0.285lgMnox+0.299）可以得到18个地区土壤EC50的预测值，将其与实测值（对数转化）进行比较，结果如图3b所示。由图可知，18个土壤EC50的预测值与实测值误差均小于0.5个数量级，误差较小，说明我国和欧洲均可运用该模型来预测土壤Mo的植物毒性阈值。

3 结论

（1）我国9 个地区不同理化性质的土壤中Mo 的大麦毒性阈值差异显著，EC10和EC50的最大值与最小值分别相差11.57倍和5.04倍。

（2）土壤阳离子交换量（CEC）是影响我国土壤Mo 毒性阈值最重要的因子，基于CEC、pH 值和锰氧化物含量3 个土壤因子，建立了我国9 个地区土壤中Mo 对大麦毒性阈值的预测模型，预测值与实测值的误差均小于0.5 个数量级，但该模型对欧洲土壤的预测结果较差。

（3）对我国和欧洲18 个地区土壤的理化性质和毒性阈值进行相关性分析，建立了适用范围更广泛的预测模型，可较为准确地预测我国和欧洲土壤中Mo 对大麦的毒性阈值。