罗汉果粗提物抑制H2O2诱导MIN6 细胞的ROS 生成及凋亡

李肖娟，李玉雪，周璐炜，王娟,2*

（1.桂林医学院药学院生药学重点实验室，广西桂林 541199）

（2.桂林医学院附属医院广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室，广西神经鞘脂代谢相关疾病基础研究重点实验室，广西桂林 541001）

罗汉果（Siraitia grosvenorii）是我国特有的珍贵葫芦科植物，是一种多年生草本藤蔓植物，主要产地为广西，此外，广东、江西、贵州、湖南等地区也有分布[1]。罗汉果素有“神仙果”之称，作为广西道地药材，一种常用的药食两用的植物，其有效活性成分的研究也已被广泛关注。在我国传统中药中，罗汉果被用作肺部缓和剂，用于治疗肺结核、哮喘、及急性支气管炎等[2]，具有镇咳祛痰、增强免疫、抗氧化损伤、润肠通便和抑癌等多种作用[3]，临床上用于治疗多种疾病，如前列腺癌、鼻咽癌、高血压、糖尿病等[4]。其果实中含有以三萜苷类为主的非糖甜味的成分，包括罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IV 及罗汉果11-O-V 和罗汉果皂苷ⅢE 等。

胰岛β细胞发生凋亡的主要原因与氧化应激密切相关[5,6]。内分泌胰岛β细胞对活性氧（ROS）比其他组织细胞更加敏感，肥胖时机体会产生过量ROS 诱导β细胞功能障碍和凋亡，进而导致代谢失衡和高血糖[7]。因此抗氧化治疗对于保护机体胰岛β细胞，减少其氧化损伤，降低血糖具有重要的作用，谈建成等[8]的研究发现，罗汉果中的皂苷和黄酮成分均具有抗氧化作用，一方面可以通过减少脂质过氧化物而增加肝脏的抗氧化能力，一方面通过清除人体胰岛β细胞的活性氧自由基，减轻胰岛细胞的损伤，改善细胞状态，回复胰岛β细胞的降血糖能力。罗汉果中另含罗汉果多糖[9]，具有多种生物活性，如降血脂、降血压、降血糖[10]、调节免疫等。黄飞[11]对罗汉果多糖降低血脂的实验结果表明，罗汉果多糖可一定程度上降低胆固醇和甘油三酯的含量，从而降低血糖，辅助治疗糖尿病，广泛应用于糖尿病人的代用糖。目前针对罗汉果提取物的研究多集中在罗汉果皂苷，国内外关于使用罗汉果粗提物对防治糖尿病的干预研究还鲜有报道。本研究以小鼠MIN6 细胞为对象，通过过氧化氢诱导MIN6 细胞的凋亡，给予不同浓度的罗汉果粗提物[12]（Momordica grosvenoriiextract，MGE），观察其对细胞的氧化损伤及细胞凋亡的影响，为罗汉果粗提物在防治糖尿病中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与药物

细胞小鼠胰岛β细胞（MIN6 细胞系）为本课题组传代保存。

罗汉果粗提物由桂林莱茵公司馈赠，样品编号LHG200618-02 2，其中提取方法参考刘辉等[13]研究方法。由高效液相色谱仪检测发现里面主要含有罗汉果苷V（53.27%），罗汉果皂苷VI（1.21%），11-氧-罗汉果皂甙V（12.26%），罗汉果皂苷IV-E（2.45%）。

1.1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清，美国CLɅRK 公司；DMEM 培养基，美国Gibco 公司；噻唑蓝（MTT），北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、H2O2，广东西陇化工有限公司；DCFH-DA，美国Sigma 公司；RIPA 强裂解液，上海碧云天生物科技有限公司；β-actin、PCNA、Bax 单克隆抗体，美国Abcam 公司；鼠二抗、兔二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL 超敏化学发光试剂，合肥Bio sharp 公司；CellXpert C170 二氧化碳细胞培养箱，德国Eppendorf 公司；AC2-4S1 生物安全柜，新加坡ESCO 公司；Infinite M200 PRO 多功能酶标仪，瑞士TECAN 公司；蛋白电泳系统、PowerPac Basic 蛋白转印系统，新加坡Bio-Rad 公司；TDZ4-WS 台式低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Centrifuge 5425 小型高速离心机，德国Eppendorf 公司；Sorvall Biofuge Stratos Centrifuge 高速冷冻离心机，德国Thermo Fisher Scientific 公司；Annexin V-FITC 凋亡试剂盒、BD Accuri C6 Plus 流式细胞仪，美国BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MIN6 细胞采用高糖DMEM 培养基（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL）置于37℃，饱和湿度5% CO2培养箱中培养。使用含EDTA胰蛋白酶消化，按照1:3 传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 药物配制

配制1×PBS 缓冲液，其中取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，KH2PO40.24 g 用双蒸水定容至1 L。罗汉果粗提物用1×PBS 缓冲液配制成浓度为200 mg/mL 母液，H2O2用1×PBS 缓冲液配制成浓度为60 mmol/L 母液，实验时根据实验所需浓度用培养基稀释，现配现用。

1.2.3 H2O2氧化应激损伤模型建立

当细胞长满整个培养皿面积80%以上时，消化并离心，每孔以2000 个细胞的密度种植于96 孔板中，每个浓度设立5 个复孔，37 ℃培养过夜，每孔加入100 μL 不同浓度H2O2（200、400、800、1200 μmol/L），24、48 和72 h 后每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO 溶液混合均匀。采用酶标仪于490 nm 波长处测定光密度值（OD），计算IC50值。

1.2.4 罗汉果粗提物对MIN6 细胞活性的影响

当细胞长满整个培养皿面积80%以上时，消化并离心，每孔以2000 个细胞的密度种植于96 孔板中，待细胞贴壁后，将罗汉果粗提物母液用完全培养基稀释成不同浓度（25、100、200、400、800、1000、1600 μg/mL），每孔100 μL 药物，每个浓度设立5 个复孔。24 h 后每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h 后弃上清，每孔加入150 μL DMSO 溶液混合均匀。采用酶标仪于490 nm 波长处测定光密度值（OD），计算IC50值。

1.2.5 MTT 检测罗汉果粗提物和H2O2对MIN6 细胞活性的影响

取对数生长期的MIN6 细胞，用PBS 洗一次，用0.25%含EDTA 的胰蛋白酶于室温消化2 min，加入培养基终止消化，将细胞悬液移至15 mL 离心管中离心（1000 r/min，5 min），弃上清，加入适当培养基，细胞计数调整细胞密度为2000 cells/孔，接种于96 孔板中，每孔加入100 μL 细胞悬液，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，细胞贴壁后，联用罗汉果粗提物及过氧化氢组，先加入100 μL 罗汉果粗提物（200 μg/mL），待药物作用1 h 后，给予H2O2（200、400、800、1200 μmol/L），空白对照组加入100 μL 完全培养基，单用罗汉果粗提物组加入100 μL浓度为200 μg/mL的罗汉果粗提物。每组设立5 个复孔，培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h 后弃上清，每孔加入150 μL DMSO 溶液混合混匀后。采用酶标仪于490 nm 波长处测定光密度值（OD）。

1.2.6 实验分组及MIN6 细胞形态观察

将实验分为空白对照组（Ctrl）、过氧化氢组（H2O2）、联用罗汉果粗提物及过氧化氢组(MGE+H2O2)、罗汉果粗提物组（MGE）。其中空白对照组仅加入完全培养基；MGE 组加入罗汉果粗提物，浓度为200 μg/mL；过氧化氢组加入过氧化氢，浓度为500 μmol/L；MGE+H2O2组加入罗汉果粗提物（200 μg/mL）及过氧化氢（500 μmol/L）。

在6 孔板中均匀接种MIN6 细胞，加入2 mL 完全培养基继续培养24 h，在显微镜下观察细胞形态。

1.2.7 细胞凋亡检测

取对数生长期MIN6 细胞种于6 孔板中，按1.2.6分组给药作用24 h 后，0.25%胰酶消化后收集细胞及上清于15 mL 离心管中，1000 r/min 离心5 min，弃上清，加入2 mL PBS 缓冲液混悬细胞沉淀再次离心，取沉淀结束后按照Annexin FITC/PI 双染检测细胞凋亡的步骤进行操作并上机检测凋亡率。

1.2.8 细胞中ROS 水平的检测

取对数生长期MIN6 细胞种于6 孔板中，待其贴壁后，按1.2.6 分组给药处理，24 h 后收集细胞，PBS洗涤3 次，每组中加入2 μmol/L 的ROS 探针DCFH-DA，避光室温染色30 min，PBS 洗涤之后流式细胞仪检测ROS 水平。

1.2.9 Western Blot 检测凋亡相关蛋白的表达

取对数生长期MIN6 细胞种于7 cm 培养皿中，按1.2.6 分组给药24 h 后，收集沉淀，加入适量裂解液冰上放置30 min 后，于4 ℃，12000 r/min 离心20 min，取上清液，BCA 法定量，用12% SDS-PAGE 电泳分离120 min，转膜70 min，5%脱脂牛奶室温封闭3 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，PBST 洗3 次，每次10 min，与二抗室温孵育1 h，PBST 洗3 次，每次10 min，加入ECL 发光液，免疫印迹成像系统检测目的蛋白。

1.2.10 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 22（IBM；USA）统计进行统计学分析，两组样本之间用独立样本t检验，多组样本之间采用单因素检验分析，以p＜0.05 具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 罗汉果粗提物预保护对H2O2诱导的MIN6 存活率的影响

2.1.1 不同浓度罗汉果粗提物对MIN6 细胞活性的影响

向小鼠胰岛MIN6 细胞中加入不同浓度罗汉果粗提物24 h 后，检测细胞活性。结果表明，当罗汉果粗提物为25、100、200、400 μg/mL 时，细胞活力分别为99.67%、98.82%、97.27%、89.32%。200 μg/mL 时细胞活力达90%以上且相对400 μg/mL 的浓度来说对细胞活力几乎无抑制作用，因此我们选用200 μg/mL罗汉果粗提物用于后续实验。（图1a）

2.1.2 罗汉果粗提物减少H2O2对MIN6细胞的影响

从石瑶瑶等[14]的研究可知，H2O2作为一种常见的活性氧，易透过细胞膜从而导致氧化损伤和凋亡，是构建细胞氧化损伤模型的常用试剂，因此本实验选择H2O2进行体外建模。MIN6 细胞经H2O2诱导后，细胞存活率明显下降，呈浓度依赖性，H2O2浓度越大，细胞存活率越低（如图1b）；计算IC50值为540 μmol/L，故后续实验选择500 μmol/L H2O2建立H2O2诱导氧化应激模型；200 μg/mL 的罗汉果粗提物预处理1 h 后分别加入不同浓度H2O2（200、400、800 和1200 μmol/L）作用于MIN6 细胞，培养24、48 和72 h，检测细胞活力。与单用H2O2组相比，罗汉果粗提物预处理后用H2O2处理各实验组细胞活力明显升高（如图1c）。以上结果发现罗汉果粗提物能将细胞活力由13.23%提高到61.48%，极显著增加800 μmol/L H2O2导致的细胞增殖减少（p＜0.01）。

同时在光学显微镜下观察细胞形态也发现，对照组（Control，Ctrl）细胞状况生长良好，细胞密度较H2O2组高，细胞膜边缘清晰可见，H2O2组细胞增殖受到抑制，细胞形态发生变化，皱缩变圆，变亮，而单用罗汉果粗提物组与对照组差异不大，这说明H2O2很可能诱导MIN6 细胞发生了死亡。罗汉果粗提物组预处理组与单用H2O2相比，预处理组细胞密度有所增加，细胞碎片减少，死细胞也相应减少，说明罗汉果粗提物对H2O2诱导的MIN6 细胞死亡具有一定的逆转作用（如图1d）。细胞存活是反映细胞活力及其增殖能力最直观的指标。各种因素导致的氧化应激能使细胞内活性氧水平升高，能损伤胰岛细胞甚至诱导其发生细胞凋亡[5]。细胞存活越高，说明氧化应激对胰岛细胞的损伤就越小。因此，细胞存活率是表明天然活性成分具有抗氧化活性的指标之一[15]。蔡小华等人[15]发现辣木叶水提物能恢复H2O2损伤细胞的存活率到100%，说明该提取物具有较强的抗氧化活性。本研究也发现200 μg/mL 罗汉果粗提物能将细胞活力由13.23%提高到61.48%，说明罗汉果提取物对H2O2诱导损伤的胰岛MIN6 细胞有良好的保护作用，能缓解H2O2对MIN6 细胞的氧化损伤。

2.2 罗汉果粗提物和H2O2 对MIN6 细胞中活性氧（ROS）的影响

胰岛β细胞表达抗氧化酶很弱，尤其对活性氧簇（ROS）比其他组织更加敏感。而体内产生过量ROS[5,6,16]会诱导胰岛β细胞功能障碍和凋亡，进而导致血糖失衡，引起代谢失调及高血糖等疾病。流式细胞术检测ROS 发现，与对照组相比，H2O2单独处理组绿色荧光显著增强（荧光强度比对照组增加了1.35倍），而单用罗汉果粗提物预处理组的ROS 含量则无明显变化，以上结果表明H2O2能增加ROS 含量，并有可能诱导MIN6 细胞的氧化损伤。用罗汉果粗提物预处理后，能降低H2O2导致的ROS 含量上升，甚至将细胞内ROS 水平降至正常，与正常组相比无显著性差异（p＞0.05），而与单用H2O2组相比，ROS 水平下降了26.86%，具有明显差异（p＜0.05），说明罗汉果粗提物可以抑制H2O2诱导的MIN6 细胞内ROS 水平升高。（如图2）。H2O2引起的氧化应激导致细胞受损，细胞存活减少甚至凋亡，罗汉果粗提物能明显降低H2O2氧化应激导致的ROS水平增高，从而能减轻ROS对小鼠胰岛β细胞的损伤和增殖抑制。

2.3 罗汉果粗提物对H2O2 诱导的MIN6 细胞凋亡作用的影响

ROS 的过度产生会导致胰岛β细胞发生氧化应激凋亡，从而导致胰岛素分泌不足和发生胰岛素抵抗等[5]。前面的细胞增殖实验提示罗汉果粗提物能明显增加MIN6 细胞的增殖，显微镜下观察也发现罗汉果提取物干预后能减少死细胞的数量，推测其对MIN6 细胞的保护作用可能与其抗细胞凋亡有关。流式细胞术结果表明，单用罗汉果粗提物处理组细胞凋亡率为（3.13%）与对照组（3.52%）差异不明显。H2O2处理组的凋亡率高达为26.12%，而罗汉果粗提物预处理后，明显减少H2O2导致的MIN6 凋亡，下降到为15.57%，与H2O2单独处理组相比差异显著（p＜0.05），活细胞的数量（Q3 象限）增加了10%（如图3）。以上结果表明罗汉果粗提物促进氧化损伤胰岛β细胞的存活，与其降低ROS 产生进而减少H2O2诱导的细胞凋亡有一定的关系。

2.4 Western blot 检测凋亡及氧化应激信号通路相关蛋白的表达

对作为细胞增殖指标之一的PCNA[17]表达进行检测，Western blot 结果显示单用H2O2组的PCNA 表达降低，降低为Ctrl 的27.02%，与对照组相比，差异极显著（p＜0.001）而罗汉果粗提物预处理后能增加PCNA的表达，比单用H2O2处理组升高37.20%，差异具有显著（p＜0.05），说明罗汉果粗提物可以减少H2O2对MIN6细胞PCNA 表达的抑制，进而促进了MIN6 细胞的存活。

细胞凋亡[18-20]是维持细胞内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡，作为一个主动的过程，细胞凋亡涉及一系列基因的激活及蛋白表达发生改变，凋亡是多基因严格控制的过程，包括Bcl-2 家族、caspase 家族、抑癌基因P53 等，其中Bcl-2[21-24]家族中包括抗凋亡和促凋亡的基因，如Bcl-2、Mcl-1、Bcl-w、Bax 等，Bax 作为促凋亡蛋白，对细胞凋亡具有重要意义。Western blot结果显示，促凋亡蛋白Bax在单用H2O2组里表达增加，用罗汉果粗提物预处理后用H2O2处理Bax 表达下降，说明罗汉果粗提物可以减少H2O2导致的Bax 增加，这可能是其具有抗凋亡活性的分子机制之一。

综上所述，说明罗汉果粗提物对H2O2诱导的增殖抑制、ROS 生成以及细胞凋亡有明显的改善作用，与其升高PCNA 的水平以及降低促凋亡蛋白Bax 的表达有关，这可能也是罗汉果发挥促增殖及抗凋亡作用的机制之一。研究表明罗汉果粗提物可通过抑制H2O2诱导的氧化应激和凋亡，促进胰岛细胞的存活，进而能改善葡萄糖刺激胰岛素分泌功能，该研究为糖尿病的预防提供了新的思路，但罗汉果粗提物对糖尿病的预防作用深层机制和临床应用仍需要进一步的探讨。

3 结论

本实验以罗汉果粗提物为研究对象，以H2O2诱导MIN6 细胞构建氧化应激损伤模型，分别从细胞增殖、细胞内ROS 水平、细胞凋亡以及增殖凋亡因子PCNA和Bax 的表达等方面探讨罗汉果粗提物对H2O2诱导MIN6 细胞氧化损伤的保护作用。结果表明，罗汉果粗提物能显著缓解H2O2引起的MIN6 细胞的增殖抑制和细胞内ROS 的增多，增加细胞促增殖因子PCNA 的表达以及减少促凋亡因子Bax 的水平，从而提高MIN6细胞的存活。以上研究表明，罗汉果粗提物具有较强的细胞抗氧化活性及抗凋亡作用，这为后续罗汉果对胰岛细胞的保护作用机制提供了研究基础，也为将罗汉果抗氧化降血糖的功能产品开发提供理论依据。