沉默N-cadherin对人牙髓干细胞增殖和迁移能力的影响

近年来，基于牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的牙髓再生是一个研究热点

。DPSCs 作为牙髓再生的重要种子细胞，其生物学特性受到复杂因素的调控

。间充质干细胞的再生潜能很大程度取决于其所处的由各种组织成分、细胞群体和可溶性因子组成的微环境

。钙黏蛋白（cadherins）是一类钙依赖性的黏附分子，目前在人类中已鉴定出100 多种，分为11 个亚家族

。它们具有不同的组织分布，E-cadherin 主要表达于上皮细胞，N-cadherin 则主要表达于间充质细胞

。Ncadherin 属于单次跨膜糖蛋白，其胞外结构域以钙离子依赖性的方式介导钙黏蛋白分子之间的相互作用，形成细胞间黏附连接；其胞内结构域不仅与细胞骨架蛋白相连从而使细胞锚定，而且与黏着斑蛋白、α-catenin 和β-catenin 等多种信号分子相互作用，调节细胞内信号转导，参与细胞增殖、凋亡、迁移和分化等生理过程

。本课题组前期研究显示，N-cadherin 表达于人DPSCs

，沉默N-cadherin可在体内外促进DPSCs 成牙本质向分化

。然而，N-cadherin 是否可以调控DPSCs 的增殖和迁移能力，尚未见报道。因此，本研究探讨沉默N-cadherin对人DPSCs 增殖和迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清、青霉素、链霉素、DMEM 培养基（Gibco，美国）；PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒、SYBR

Premix Ex TaqTM 试剂盒（Takara，日本）；蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、磷酸酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，中国）；N-cadherin 抗体（Santa Cruz，美国）；GAPDH 抗体、羊抗兔IgG 二抗（Abcam，美国）；CCK-8 试剂（同仁，日本）；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（凯基，中国）；Transwell 小室（Corning，美国）；CO

恒温培养箱（Thermo Forma 311，Thermo，美国）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo，美国）；MD 多功能酶标仪（SpectraMax M5，Molecular Devices，美国）；流式细胞仪（FACSCanto II，BD，美国）；实时荧光定量PCR 系统（Light Cycler 480，Roche，瑞士）；倒置相差显微镜（IX71，Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 DPSCs 培养 本实验关于人离体牙及DPSCs 的使用已获得南方医科大学南方医院医学伦理委员会的批准（审批号：NFEC-2017-017）。在签署知情同意书的前提下，于南方医院口腔颌面外科门诊收集13～18 岁因正畸需要而拔除的健康前磨牙，采用改良组织块酶消化法分离培养人DPSCs

。将DPSCs 接种于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基中，放置于37 ℃、5%CO

的孵箱中培养。使用第3 代或第4 代DPSCs 进行实验。

1.2.2 慢病毒转染 本实验所使用慢病毒由上海吉凯基因公司提供，慢病毒载体为GV248，元件顺序为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。Ncadherin shRNA 沉默组干扰靶点序列为5'-AGTGACTATTAAGAGAAAT-3'，阴性对照组（shRNANC）靶点序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。将DPSCs 以3×10

个/mL 密度接种于6 孔板，慢病毒以50∶1 的感染复数加入细胞中，10 h 后更换病毒液为正常培养基，继续培养72 h 后检测转染效率。

1.2.3 qRT-PCR 检测N-cadherin 的mRNA 表达 慢病毒转染DPSCs 72 h 后，Trizol 法提取细胞总RNA，NanoDrop 测定RNA 纯度、浓度，使用Prime-Script

RT Master Mix 试剂盒将RNA 逆转录合成cDNA，以SYBR

Premix Ex Taq

试剂盒进行实时荧光定量PCR 反应，以GAPDH 作为对照，目的基因的相对表达量通过2

方法计算。相关基因的引物序列见表1。

传统农业植保工作的开展，以大型机械、人工操作为主导，前者具有作业效率高的特点，但却存在设备成本高的缺陷；后者呈现耗时长、人力资源多的问题［2］。而在无人机技术的衍生下，植保无人机的使用改变了传统植保模式，使植保工作更具快速性、高效性。植保无人机的优点具体如下。

试验产品为复合纺丝制备的PE/PA6皮芯型复合纤维FDY，皮层为PE材料，芯层为PA6材料。试验纺丝流程如下：

通过非连续性文本这个点，带动了现代文阅读的一片文，就好比将现代文阅读主观题的应对关节打通了——找到了能动起来、施展开来的思维常法。我顺势提醒学生——既然“点动成线”的有文章可做，那么“线动成面”呢——这里的“面”可以是古诗文阅读、连贯衔接逻辑推断、作文审题立意完篇……各个板块，它们共同构成了语文备考这个“面”。

在细胞接种后的第3 天，shRNA-NC 组与Ncadherin shRNA 组间凋亡细胞比例差异无统计学意义（

= 1.322，

＞0.05）（图4）；在细胞接种后的第6 天，N-cadherin shRNA 组凋亡细胞比例大于shRNA-NC 组，差异具有统计学意义（

=6.166，

＜0.01）（图4）。

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期 收集培养至第3 天和第6 天的shRNA-NC 组和N-cadherin shRNA组DPSCs，加入70%乙醇在4 ℃条件下固定过夜，PBS 洗去固定液，1 000 rpm 离心3 min；将细胞周期检测试剂盒中的RNase A 和PI 以1∶9 的体积比例配制染色工作液；在上述细胞样品中加入500 μL新鲜配制的RNase A/PI 染色工作液，在室温避光环境下反应30 min，上机进行流式细胞仪检测，记录激发波长488 nm 处红色荧光。

1.2.4 Western blot 检测N-cadherin 蛋白表达 慢病毒转染DPSCs 72 h 后，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法检测总蛋白浓度，蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至聚偏二氟乙烯膜上，脱脂奶粉室温封闭2 h，加入N-cadherin（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗，4 ℃摇动孵育过夜，然后加入相应二抗（1∶5 000）室温摇动孵育1 h，洗膜后化学发光显影并拍照记录，Image J 软件进行蛋白条带灰度分析。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 收集培养至第3 天和第6 天的shRNA-NC 组和N-cadherin shRNA组DPSCs，PBS 洗涤，按照细胞凋亡检测试剂盒加入5 μL Annexin V-EGFP 混匀，再加入5 μL PI 混匀，在室温避光环境下反应15 min，在1 h 内上机进行流式细胞仪检测。

N-cadherin 可通过多种信号通路调节细胞增殖、凋亡、迁移和分化等生物学行为。本研究结果显示，沉默DPSCs 中N-cadherin 的表达后，细胞的增殖活性呈现早期增高后期减低的趋势；在DPSCs增殖早期，沉默N-cadherin 的表达可通过促进细胞周期进展从而增加细胞的增殖活性；而在DPSCs增殖后期，沉默N-cadherin 的表达可通过促进细胞凋亡和阻碍细胞周期进展从而降低细胞的增殖活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差表示，两组间比较用

检验，多组间比较用单因素方差分析。

＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 稳定低表达N-cadherin DPSCs 的构建

转染慢病毒后72 h，采用qRT-PCR 和Western blot 分别从mRNA 和蛋白水平检测DPSCs 中N-cadherin 的表达水平。结果显示，N-cadherin shRNA 组N-cadherin 的表达水平显著低于shRNA-NC 组和blank 组（

=80.76，

＜0.001）（图1）。

2.2 沉默N-cadherin 对DPSCs 增殖能力的影响

刘坚认为，农业是国家稳定的磐石，中国农药产业为中国农业作出不可磨灭的贡献，为农产品丰收立下汗马功劳。然而，目前谈药色变的情况依旧，社会对农药产业仍存误解，唯有认清农药产业的发展大势，明晰发展思路，全力打造一批新型绿色农药企业，才是解决当前农药产业问题的着力点。接下来，农药企业必须紧握安全之桨，高扬绿色之帆，确保农药产业成为撬动乡村振兴的有力杠杆，以切实举措为国家粮食安全消除后顾之忧。

2.3 沉默N-cadherin 对DPSCs 细胞周期的影响

在低细胞密度时，N-cadherin shRNA 组穿过小孔的细胞数量多于shRNA-NC 组，差异具有统计学意义（

= 8.81，

＜0.001）；在高细胞密度时，N-cadherin shRNA 组穿过小孔的细胞数量亦多于shRNA-NC 组（

=15.5，

＜0.001）（图5）。

2.4 沉默N-cadherin 对DPSCs 凋亡的影响

1.2.5 CCK-8 法检测细胞增殖 将shRNA-NC 组和N-cadherin shRNA 组DPSCs 以3×l0

个/孔的密度接种于96 孔板中，于第1～8 天进行检测，每个时间点设置6 个复孔。加入10 μL/孔CCK-8 试剂，避光孵育2 h，酶标仪检测450 nm 波长处的OD 值。

与shRNA-NC 组相比，N-cadherin shRNA 组细胞增殖活性在第1、2、5 天变化无统计学意义（

＞0.05），第3、4 天细胞增殖活性增高，差异有统计学意义（

＜0.05），第6、7、8 天（

＜0.05）细胞增殖活性降低（图2）。

2.5 沉默N-cadherin 对DPSCs 迁移能力的影响

在细胞接种后第3 天，与shRNA-NC 组相比，N-cadherin shRNA 组细胞处于G1 期的比例降低，处于S 期和G2 期的比例升高，差异均具有统计学意义（

= 3.959，

＜0.05）（图3）；细胞接种后第6 天，N-cadherin shRNA 组细胞处于G1 期的比例大于shRNA-NC 组，N-cadherin shRNA 组细胞处于S 期和G2 期的比例则低于shRNA-NC 组（

=3.763，

＜0.05）（图3）。

3 讨 论

1.2.8 Transwell 法检测细胞迁移能力 shRNA-NC组和N-cadherin shRNA 组DPSCs 以2×l0

个（代表低密度）和5×10

个（代表高密度）的数量接种于Transwell 小室的上室，上室加入不含血清的DMEM 培养基，下室加入含有10% FBS 的DMEM 培养基，将细胞放置于孵箱培养20 h。用棉签拭去上室表面的细胞，上室底面的细胞则采用无水甲醇固定15 min，PBS 漂洗后，对其进行结晶紫染色，室温孵育15 min，PBS 漂洗至液体澄清。显微镜下观察，拍照记录实验结果，随机选取5 个视野进行细胞计数。

研究表明，细胞密度影响细胞的生物学特性，细胞活性和增殖能力随着细胞融合度的增加而增强，在80%融合度时达到顶峰，而在达到100 %细胞汇合时则明显下降

。值得关注的是，随着时间的推移，骨髓间充质干细胞的密度增加，N-cadherin 的表达水平则明显下降

。在体外和体内过表达N-cadherin 均可抑制成骨细胞增殖，促进细胞凋亡

。这些结果提示N-cadherin 可能对细胞的增殖能力起负性调节作用，这也与本研究结果一致，即在细胞未达到100%融合度时，沉默N-cadherin 的表达可促进DPSCs 的增殖活性，但在细胞达到100%融合度后，沉默N-cadherin 的表达不仅可促进细胞凋亡，而且可阻碍细胞周期进展，从而降低细胞的增殖活性，这可能与细胞由增殖转向分化有关

，本课题组前期研究也显示，沉默Ncadherin 可在体内外促进DPSCs 成牙本质向分化

。本研究证明沉默DPSCs 中N-cadherin 的表达可改变细胞周期和凋亡从而影响早期和后期的细胞增殖活性，并推测早期与后期细胞密度的不同可能在其中起着决定性的作用。然而，仍需进一步通过检测不同细胞密度条件下DPSCs 中N-cadherin 的表达水平以及研究其中的分子机制为上述推测提供更多证据。

从技术层面，主要从信息输出、加工、使用三个方面来比较BIM与传统项目管理系统的区别。工程项目参与方较多，信息输入多停留在本部门或者单体工程的界面，易形成质量信息孤岛。整个工程的相互传输不及时，阻碍了整个工程的信息统计汇总。建设行业是大数据行业，工程的图纸、文件、资料等质量文档，一般以纸质的形式保存，电子文件格式繁多，没有统一的数据接口，造成无法随时查询工程质量信息，影响了质量管理和信息的使用效率（见图3）。

本研究发现，沉默N-cadherin 表达无论是在低细胞密度还是在高细胞密度时均可促进细胞迁移能力。N-cadherin 对细胞迁移的能力的作用受到不同细胞来源的影响。N-cadherin 在上皮源性肿瘤细胞的侵袭转移方面发挥重要作用，通常作为肿瘤细胞获得侵袭转移能力的标志

。然而，在间充质来源的小鼠骨肉瘤细胞系中，N-cadherin 呈现出低表达水平，过表达N-cadherin 可抑制体外细胞的迁移能力以及体内肺转移的能力

。因此，DPSCs 来源于间充质的属性有可能决定了沉默Ncadherin 对DPSCs 迁移能力的促进作用。

综上所述，沉默N-cadherin 可促进DPSCs 增殖、迁移，当细胞达到融合后则转向成牙本质向分化，从而促进牙髓-牙本质复合体再生，但其中的分子机制需要更深入的探索。

1.2.3 咳嗽运动训练 患者可采用坐姿或半卧位，将手掌轻按胸部，当咳嗽时以手支撑，教会患者做一深吸气，自肺部深部咳嗽;连续3次短吸气后，咳嗽1声。

Deng ZL performed the research, and wrote the article. Yan WJ, Zhao WH revised the article. Wu BL designed the study.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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