时间与缺血程度对皮瓣延迟效果的影响探讨

陈绍锋，荆幸，方芳，范莹娟，庄跃宏*

1.福建省高校脑老化与神经变性疾病重点实验室，福建医科大学基础医学院人体解剖学系，临床应用解剖学研究所，福州 350122；2.福建医科大学药学院实验中心，福州 350122

较大面积的皮瓣坏死会给患者带来极大的心理与生理负担，因此研究如何促进皮瓣术后血供的重构，提高皮瓣的存活率一直是皮瓣研究的热点[1]。而目前唯一在临床上被实践并肯定能促进皮瓣存活的方式为皮瓣延迟术[2]。皮瓣延迟是指为了皮瓣的完全形成和转移而需进行另外一次或多次手术的过程，通过皮瓣延迟术形成的皮瓣即是延迟皮瓣[3]。对于大面积皮肤软组织的修复，预先性地、策略性地进行皮瓣延迟成为临床实践中一种可靠的、有效的提高皮瓣移植存活面积的外科方法。目前关于皮瓣延迟的手术方式及延迟时间还存在争议，因此本研究在小鼠背部建立延迟皮瓣模型，对以上两个因素在延迟过程中所起到的效果进行探讨。现将本研究报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备

清洁级5 周龄雄性ICR 小鼠125 只，体重（25±3）g，由福建医科大学实验动物中心提供（批号：SCXK(闽)2016-0002）。随机等分入5 组：对照组、留血管7 d 组与14 d 组及切血管7 d 组与14 d 组，每组25 只。对照组的小鼠，背部切取4.5 cm×1.5 cm 的以髂腰血管为蒂的长方形半岛状皮瓣（图1 a）。留血管14 d 组及7 d 组小鼠，先切开皮瓣两侧皮肤，保留蒂部髂腰血管及胸背血管尾侧支，后缝合皮瓣，于术后14 d 及7 d再次形成与对照组一样的皮瓣。切血管延迟14 d 及7 d 组小鼠，先切开皮瓣两侧皮肤，保留蒂部髂腰血管，但切断胸背血管尾侧支，后缝合皮瓣，于术后14 d及7 d 再次形成与对照组一样的皮瓣（图1b、1c）。

图1 5 组小鼠手术方式粉紫色边框线条表示皮肤切开的部位；红色表示皮瓣内血管。(a)对照组皮瓣术式：切开皮瓣两侧及头侧皮肤，切断胸背血管，保留髂腰血管及其尾端皮肤，后原位缝合，形成半岛状皮瓣。（b）切血管7 d 与14 d 组：切开皮瓣两侧长轴，切断胸背血管尾侧支，后缝合；7 d 或14 d 后，再次形成与对照组一样的皮瓣。（c）留血管14 d 组及7 d 组：切开皮瓣两侧皮肤，保留胸背血管尾侧支，后缝合；7 d 或14 d 后，再次形成与对照组一样的皮瓣。Fig.1 Surgical models of 5 groups of miceThe pink purple border lines indicate the position of the flap;Red drawings indicate the blood vessels in the flap；(a) the flap in the control group:incise the skin on the lateral and cranial margins of the flap,dividing the thoracodorsal vessels and preserving the iliolumbar vessels and the skin pedicle.Then the flap is sutured back in situ to form a peninsular flap；(b) the flap in vessels-transection 7 and 14-day groups:incise the bilateral margins of the flap,transect the caudal branch of thoracodorsal vessels,and then suture the flap.After 7 or 14 days,the same flap model as the control group is established again;（c) vessels-preservation 7 and 14-day groups:incise the bilateral margins of the flap,preserve the caudal branch of thoracodorsal vessels,and then suture the flap.After 7 or 14 days,the same flap model as the control group is established again.

1.2 皮瓣坏死率计算

对术后7 d 皮瓣进行拍照，后将照片导入Adobe Photoshop CS5，利用直方图功能统计皮瓣坏死率。皮瓣坏死率=坏死部分像素/皮瓣总像素。

1.3 激光散斑衬比成像仪测量术后皮瓣血管管径与血流灌注的变化

皮瓣完全形成后0、1、2、3 及7 d，将每个时间点的5 只小鼠皮瓣掀开，利用激光散斑衬比成像仪（瑞沃德生命科技有限公司）对皮瓣血管网的血流灌注情况进行拍照及分析。由于本实验所用到的仪器每次能拍摄的区域为1 cm×1.5 cm，故为了显示整个皮瓣的灌注情况，我们对每个皮瓣从尾端到头端拍照4 至5 次，最后将得到的照片输入到Adobe Photoshop CS5内，合成皮瓣血流灌注的全景图。图片采集之后，我们对皮瓣蒂部及Choke 区动脉管径及灌注进行测量。

1.4 血管内皮标志计算血管密度

取各组皮瓣完全掀起后0 d 和7 d 皮瓣远端的存活组织，行常规冰冻切片及免疫荧光染色，利用CD31抗体对血管内皮进行标记。封片后，在20×镜下随机取3 个视野摄像。之后，将图像导入Adobe Photoshop CS5，利用魔棒工具对照片中红色荧光的区域（血管内皮）进行选择。之后利用直方图功能得到红色荧光所代表的血管的像素，并将该像素除以整个视野的像素。3 个视野的平均血管密度代表了该皮瓣的血管密度。

1.5 统计分析

所有数据均以表示。采用单因素方差分析（ANOVA）对各组皮瓣的血流灌注、蒂部穿支动脉管径、坏死率及皮瓣内的血管密度的差异进行统计学分析，采用LSD 法进行两两比较。P＜0.05 表示差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 延迟显著减少皮瓣坏死率

对照组、留血管7 d 组、留血管14 d 组、切血管7 d组及切血管14 d 组的皮瓣坏死率分别为(39.0±3.2)%、(22.8±1.8)%、(23.4±2.2)%、(1.3±0.8)%及(1.2±0.7)%，5组皮瓣坏死率有显著统计学意义（P＜0.001）。各延迟组皮瓣的坏死率均显著小于对照组(P＜0.001)；两延迟切血管组皮瓣坏死率均显著小于两延迟留血管组皮瓣坏死率(P＜0.001)，而两保留血管组之间与两切血管组之间的皮瓣坏死率没有统计学差异（P=0.951 与0.648）（图2）。

图2 术后7 d 5 组皮瓣坏死的代表性图片***P＜0.001，坏死率有极显著差异 △P＞0.05，差别无统计学意义Fig.2 Representative pictures of flap necrosis in 5 groups 7 on days after surgery*** P＜0.001 indicates there was significant difference in necrosis rate;△P＞0.05 indicates no significant difference

2.2 延迟显著促进蒂部与Choke 区动脉的扩张

皮瓣完全形成后即刻，5 组皮瓣蒂部及choke 区的动脉管径均具有极显著统计学意义（P＜0.001）。两留血管组蒂部与choke 区的动脉管径无显著统计学差异（P=0.733 及P=0.820），为对照组蒂部与choke 区相应部位管径的1.3 及1.2 倍（P＜0.001）。切血管7 d组与14 d 组的蒂部与choke 区的动脉管径无统计学差异（P=0.398 及0.075），但都极显著大于对照组与留血管延迟组：这两组蒂部及choke 区动脉管径分别约为对照组的1.4 与1.3 倍（P均小于0.001），以及约达到留血管灌注组相应部位管径的1.1 与1.2 倍（P均小于0.01）。

蒂部髂腰动脉及Choke 区动脉的管径都持续变大，其中术后1d 内扩张幅度最大，尤见于对照组（图3）；术后2d 起，虽然各组蒂部及Choke 区动脉继续扩大，但幅度趋缓。至术后7 d，5 组皮瓣蒂部髂腰动脉及choke 区动脉管径仍具有极显著统计学差异（P=0.002 与P＜0.001）。但在该时间点留血管7 d 组与14 d 组蒂部髂腰动脉的管径与对照组蒂部的管径没有显著统计学差异（P=0.276 与0.077），但choke 区动脉的管径仍显著大于对照组，约为对照组的1.2 倍（P=0.001 与0.002）。切血管7 d 组 与14 d 组的蒂部与choke 区的动脉管径无统计学差异（P=0.814 及0.372），但都极显著大于对照组（P均小于0.001），分别为对照组相应部位管径的1.4 与1.2 倍；与留血管组相比，两切血管组choke 区动脉的管径约达到留血管组相应部位管径的1.1（P均小于0.001），但是蒂部血管管径与留血管组皮瓣相比没有显著统计学差异（P均大于0.05）。5 组在皮瓣完全形成后0 d 和7 d 蒂部动脉与Choke 区动脉管径的具体数据见(表1)。

图3 皮瓣完全形成7 d 内蒂部髂腰动脉和choke 区动脉管径的变化趋势切血管延迟7 d 组与14 d 组动脉变化曲线显著高于不切血管延迟7 d 组与组，后者又显著高于对照组Fig.3 Change trend of the diameter of the iliolumbar artery at the pedicle and the artery in the choke area within one week after the complete formation of the flapThe arterial change curve in the groups with 7 days and 14 days of vessels-transection delay is significantly higher than that in the groups with 7 days and 14 days of vessels-preservation delay,and the latter is significantly higher than that in the control group

表1 5 组皮瓣完全形成后0 d 和7 d 蒂部与Choke 区动脉管径（,μm）Tab.1 Diameter of the iliolumbar artery in the pedicle and choke area at 0 and 7 days after complete flap formation in 5 groups (Mean±SD,μm)

表1 5 组皮瓣完全形成后0 d 和7 d 蒂部与Choke 区动脉管径（,μm）Tab.1 Diameter of the iliolumbar artery in the pedicle and choke area at 0 and 7 days after complete flap formation in 5 groups (Mean±SD,μm)

2.3 延迟显著增加蒂部与choke 区血流灌注

皮瓣完全形成即刻，5 组蒂部与choke 区的灌注强度差异具有极显著统计学意义（P＜0.001）（图4 与5）。留血管延迟7 d 与14 d 组的蒂部、choke 区及远端3 个部位的灌注强度无统计学差异（P=0.871、0.959 及0.552），但都极显著高于对照组，分别约为对照组的蒂部及choke 区灌注的2.0、1.9 及1.8 倍（P均小于0.01）；切血管延迟7 d 与14 d 组的灌注强度无统计学差异（P=0.594、0.937 及0.351），但都极显著大于对照组与留血管延迟组：该组蒂部、choke 区及远端3 个部位灌注约达到对照组相应部位的7.3、8.4 及6.8 倍（P均小于0.001），以及约达到留血管灌注组相应部位灌注的3.6、4.4 及3.4 倍倍（P均小于0.001）。

图4 5 组皮瓣完全形成后5 个时间点蒂部、choke 区及远端的血流灌注的折线图Fig.4 Line charts of blood perfusion in pedicle,choke area and distal part at 5 time points after complete formation of flaps in 5 groups

5 组蒂部髂腰动脉的灌注随着术后时间点延长而增大，其中以留血管延迟组变化幅度最大，对照组此次，切血管延迟组增加最小。5 组皮瓣choke 区的灌注随着术后时间点的增加都有小幅度增加。由于对照组远端很快出现全部坏死，故对照组皮瓣远端的灌注几乎不出现变化；而4 个延迟组的皮瓣远端的灌注都随着时间逐渐增强，其中切血管延迟组皮瓣远端灌注的增加幅度远大于留血管延迟组。

皮瓣完全形成后7 d，5 组皮瓣2 个部位的血流灌注仍具有显著统计学差异（P＜0.001）；留血管延迟7 d组与14 d 组的灌注强度无统计学差异（P=0.107，0.202及0.761），但仍都极显著高于对照组，分别约为对照组蒂部、choke 区及远端灌注的1.6、1.9 及2.1 倍（P均小于0.001）；切血管延迟7 d 组与14 d 组的灌注强度无统计学差异（P=0.949，0.890 及0.257），但都极显著大于对照组与留血管延迟组：该组蒂部及choke 区部位灌注约达到对照组相应部位的2.3、4.5 及8.1 倍（P均小于0.001），以及约达到留血管灌注组相应部位灌注的1.4、1.4 及3.8 倍（P均小于0.001）（表2）。

表2 5 组皮瓣完全形成后2 个时间点3 个部位的血流灌注强度数据（,PU）Tab.2 Data regarding blood perfusion intensity of three parts in flaps of 5 groups at 2 time points after complete flap formation (Mean±SD,PU)

表2 5 组皮瓣完全形成后2 个时间点3 个部位的血流灌注强度数据（,PU）Tab.2 Data regarding blood perfusion intensity of three parts in flaps of 5 groups at 2 time points after complete flap formation (Mean±SD,PU)

从散斑成像可见，术后即刻对照组只有蒂部有明显血流，choke 区及胸背血管体均无明显血流，之后蒂部及choke 区逐渐出现血流，但是远端胸背血管体由于坏死，术后7d 均无血流出现；留血管延迟7d 组与14d 组术后即刻，与对照组相比，除了蒂部血管体的血供明显增强，choke 区已经可见较弱血流，之后choke 区血流逐渐变强，至术后第7 天，皮瓣远端也慢慢出现较弱血流；切血管延迟7d 组与14d 组术后即刻可见choke 血管的明显扩张，将蒂部髂腰血管体与远端胸背血管体融为一个大的血管体，使choke 区与胸背血管体在术后即刻便可见明显血流灌注，之后随着choke 血管进一步扩张，出现了血管扩张后血管的“扭曲”现象（图5）。

图5 5 组皮瓣完全形成后0d 与7d 激光散斑衬比图片a,b,c,d 及e 显示的是皮瓣完全形成后即刻对照组、留血管7 d 组与14 d 组、切血管7 d 组与14 d 组的血流灌注图片；f,g,h,i 及j 显示的皮瓣完全形成后7 d 相对应组别的血流灌注图片Fig.5 Perfusion images collected using laser speckling imaging at 0 and 7 days after complete flap formation in 5 groupsa,b,c,d and e show the blood perfusion images of the control group,the vessels-preservation 1-week and 2-week groups,and the vessels-transection the 1-week and 2-week groups;f,g,h,i and j showed the blood perfusion images of the corresponding groups 7 days after complete formation of the flap

2.4 微血管密度分析

在皮瓣完全掀起后即刻，5 组皮瓣的血管密度有极显著统计学意义(P＜0.001):两留血管组之间（P=0.374）及两切血管组之间(P=0.756)的血管密度均没有统计学差异,各延迟组的微血管密度要显著高于对照组(P＞0.05)，两延迟切血管组的血管密度均显著大于两延迟留血管组，之间差异具有统计学意义(P＜0.05)（图6）。术后7d，5 组皮瓣内的血管密度没有统计学差异（P=0.883）（表3）。

图6 CD31 特异性抗体标记的血管内皮细胞免疫荧光染色结果图左为5 组皮瓣红色荧光抗体标记的血管内皮细胞荧光染色对比图，红色部分所占面积越大表示微血管密度越高(标尺=250 μm)；图右为五组皮瓣血管密度的统计图，★表示皮瓣完全掀起即刻，5 组皮瓣的血管密度有统计学差异（P＜0.001）；●表示皮瓣完全掀起即刻，两切血管延迟组血管密度显著高于两留血管组皮瓣内血管密度（P＜0.05）；▲表示皮瓣完全掀起即刻，留血管延迟两组及切血管延迟两组之间的血管密度之间无显著统计学差异（P＞0.05）；同时，皮瓣完全掀起7 d，5 组血管密度没有统计学差异（P＞0.05）。Fig.6 Immunofluorescent staining of vascular endothelial cells using anti-CD31 antibodyOn the left is the fluorescent staining contrast diagram of vascular endothelial cells labeled with red fluorescent antibody in 5 groups of flaps.The more the area of red part,the higher the density of microvessels (bar=250 μm).On the right is the statistical graph of vascular density of five groups of flaps,★indicates significant difference of the vascular density of the five groups immediately after complete flap formation.(P＜0.001);●it indicates that immediately after complete flap formation,the vascular density in the two vessels-transection groups is significantly higher than that in the two vesselspreservation groups (P＜0.05);▲indicates no significant difference in vascular density between the two vessels-preservation groups and the two vesselstransection groups (P＞0.05);Meanwhile,there is no significant difference in vascular density among the five groups at day 7 after complete flap formation(P＞0.05).

表3 术后0 d 与7 d 5 组皮瓣的血管密度Tab.3 Vascular density of five groups of flaps at 0 and 7 days after surgery

3 讨论

延迟的最佳时机目前尚无定论，有人认为7 d 后皮瓣内血管重构，增粗的效应就开始减缓，所以提出7 d 后转移延迟皮瓣即可[4][5]，也有学者认为14 d 之内皮瓣内血管重构一直进行得非常活跃，所以提出14 d转移延迟皮瓣为最佳时机[6,7]。本研究利用动物实验对该时效进行研究，试图找到一个延迟皮瓣的“成熟点”，给临床上皮瓣的延迟术所需的时间窗提供理论指导。此外，关于不同手术方式对皮瓣血流动力学及最终皮瓣坏死率的影响目前文献鲜有报道，因此本研究利用小鼠皮肤血管的特点，对此问题也进行了探讨。

我们的结果显示，相同延迟方式，延迟7 d 与14 d皮瓣的存活率、动脉管径、血流灌注及血管密度都没有统计学差异，提示延迟7 d，延迟所带来的血流动力学的改善便已经达到最大化，对皮瓣完全切取后的保护效果也达到了最大化，因此我们认为7 d 为皮瓣延迟的成熟点。此外，对皮瓣存活影响最大的因素为延迟期间皮瓣中、远段的缺血程度。在延迟期间如果按照双蒂延迟方式，只切开皮瓣两侧的皮肤，而对从肌肉进入瓣部的血管不进行处理，虽然也能制造炎症环境，促进蒂部和choke 区血管的预先扩张，提高完全掀起后皮瓣的血流量，但是其延迟效果远不如在双蒂的基础上切断胸背动脉的术式，原因为后者可以造成更为严重的组织缺血。可以观察到，切断胸背动脉后延迟7～14 d 组的皮瓣坏死率约为1%，远低于留胸背动脉延迟7～14 d 组约23%的坏死率及对照组高达39%的坏死率。经过管径测量可知，虽然对照组皮瓣在切取后蒂部及choke 区动脉能够进行较为快速的扩张，但是即使到了术后7 d，其两个部位动脉的管径仍然极显著小于切胸背动脉延迟7～14 d 组在皮瓣掀起即刻的管径，说明延迟期间胸背动脉切断所造成缺血、缺氧环境及血流压力平衡的打破能够极大程度地促进皮瓣的血管扩张。而保留胸背动脉的延迟术式虽然能够造成皮瓣两个部位动脉一定程度的扩张，但是其幅度远不如切胸背动脉延迟术。

从散斑图像可以看出，对照组刚掀起时choke 区与皮瓣远端都处于极度缺血状态；术后7 d，choke 区血流有所恢复，但是皮瓣远端已经坏死。留血管延迟组由于延迟期间蒂部与choke 区血管一定程度的扩张，在术后即刻便能够将血液少部分送到choke 区，但是皮瓣远端仍然处于一个极度缺血状态；术后7 d，随着蒂部及choke 区动脉的继续扩张，皮瓣远端灌注有了改善，但远离choke 区部分的皮瓣组织出现了坏死。而切血管延迟组的皮瓣在完全掀起即刻，即可看到蒂部血管体通过扩张的choke 区与远端的胸背血管体融为一个大的血管体，使蒂部choke 区及远端灌注约达到对照组相应部位的2.3、4.5及8.1倍，蒂部血流能够轻松到达远端，保证皮瓣远端的几乎完全存活。

我们对皮瓣血流动力学的研究提示，在行皮瓣延迟术时，要尽量保证延迟期间除蒂部之外所有的动脉的结扎。不过在临床具体实施的时候，有个难点，也就是要保证切断除蒂部供血动脉之外皮瓣尽可能多的穿支，但又要保证皮瓣不要在延迟期间坏死，如本动物实验中在延迟期间保留胸背动脉头侧支，否则皮瓣在延迟期间就会出现坏死。因此，临床上报道的间歇阻隔法是非常好的方法：也就是行延迟手术的时候，保留所有进入皮瓣的穿支，然后在除蒂部之外的穿支上放置活结（不打紧），在术后每隔1～2 d 结扎掉一根穿支。该手术最关键的为间隔时间的长短，间隔太长增加患者负担，间隔太短怕重构还不成熟，影响延迟效果，因此之后动物实验可以在这方面着力。

一般文献都关注延迟期间血管体之间的choke 血管的动脉扩张[8，9]，本研究提示除了choke 动脉的扩张之外，蒂部动脉的扩张也起到了非常重要的作用。切血管延迟组的皮瓣完全掀起后的动脉管径为对照组1.4 倍，灌注强度更是达到对照组的7.3 倍，意味着综合血流量达到对照组的10.2 倍。蒂部管径的扩张相当了将皮瓣设计到了具有一个更大穿支的部位，为皮瓣掀起后血供直达远端创造了先天条件。对5 组皮瓣的血管染色提示，切血管延迟术所造成的严重缺血缺氧有利于血管新生，但是该新生过程7 d 便能达到最大化，增加延迟时间不能继续提高血管密度。之后，在皮瓣完全掀起之后，由于对照组缺血缺氧更严重，所以反而更有利于血管新生，造成5 组皮瓣在皮瓣完全掀起后7 d 的血管密度没有统计学意义。该研究提示延迟术同时从血管扩张与血管新生两个方面同时着力促进皮瓣的存活。

综上所述，本研究提示延迟时间只需要7d 便能达到最佳延迟效果。此外，为了达到最好的延迟效果，外科医生应该在延迟期间不造成坏死的情况下尽可能切断除蒂部之外所有进入皮瓣的动脉，给皮瓣造成尽可能严重的缺血缺氧。