养猪废水处理工艺对耐药基因迁移影响研究进展

杨礼震，刘天琪，王禄禄，曹芸芸，周文兵，肖乃东，蔡建波

华中农业大学资源与环境学院/生猪健康养殖省部共建协同创新中心，武汉 430070

为预防动物疾病和保证动物产品稳产高产，畜禽养殖业广泛使用抗生素。然而，抗生素的使用会使细菌产生耐药基因，养殖废弃物是导致环境中抗生素及耐药基因污染的重要来源之一。到2050年，预计全世界每年将有1 000万人因抗生素耐药性而死亡，卫生部门经济负担将高达100万亿美元[1]。我国是世界上最大的生猪生产国，养猪场每年产生大量含抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）的废水[2]。污水处理系统是养猪场必不可少的环保设施，然而，当前养猪场污水处理系统多为降低有机物（化学需氧量）、氨氮等污染物而设计，对于残留ARGs的污染问题尚未引起足够关注[3]。

生猪肠道中微生物受到抗生素压力胁迫发生基因突变而产生的ARGs，可通过水平基因转移和垂直基因转移2种方式促使细菌耐药性发生转移，导致ARGs类环境问题不断产生[4]。含ARGs的废水进入到污水处理系统后可随废水排出进入水、空气和土壤环境中，进而通过呼吸作用和食物链对人类产生危害。养猪场内抗生素转移传递方式如图1所示。不同类型的抗生素以及污水处理方式使得细菌中抗生素耐药性有所差异。携带ARGs的可移动遗传元件也可在动物和人类之间的不同肠道微生物群之间进行传播[5]。在复杂环境体系中，细菌间会相互影响，如一些敏感细菌可与耐药细菌相互作用而共存[6]。因此，水样环境越复杂越难以调查废水中ARGs的作用方式。笔者针对养猪废水处理工艺中ARGs污染问题，结合国内外最新文献报道，阐述生猪养殖场内ARGs污染情况，介绍养猪废水处理工艺的几种关键方法，以期为养猪废水处理工艺去除ARGs提供技术参考，促进我国生猪养殖绿色可持续发展。

图1 抗生素在养猪场内传播路径Fig.1 Transmission routes of antibiotics in swine farms

1 生猪养殖场耐药基因的产生

1.1 生猪肠道内抗生素及抗性基因的产生

在生猪养殖过程中，抗生素的长期使用，导致ARGs的出现和耐药菌的增加。生猪肠道微生物群作为ARGs的潜在储存库已逐渐引起人们关注[7]。生猪肠道微生物能维持宿主代谢稳态，保障多种生理、神经和免疫功能。生猪肠道微生物相互作用会影响微生物群落的功能和结构，如真菌可以影响细菌生长，噬菌体能够调节细菌的多样性，但目前关于ARGs的研究主要集中于细菌，对真菌、病毒等微生物的研究则相对较少[8]。为了促进生猪生长，常在饲料中添加抗生素，饲料中抗生素添加剂量一般在2.5～125 mg/kg[9]，然而30%～90%的抗生素不能被生猪肠道吸收而被直接以粪便排出，同时ARGs也随着耐药菌一起排出并进入环境，从而进一步对ARGs的产生造成选择性压力[10]。

国内很多学者在生猪肠道中检测出ARGs[11]，在生猪肠道中含有大量微生物菌群，其数量超过宿主细胞。抗生素的使用会使生猪肠道内微生物群发生紊乱，例如，在生猪保育期和生长期使用抗生素会导致肠道微生物生态失调，与对照组相比，使用泰乐菌素的生猪肠道中乳酸杆菌和醋杆菌属占有较大的丰度[12-13]。生猪肠道微生物群中的病原体，具有向人类传播抗生素耐药性潜力[12，14]。针对复杂的肠道微生物群，消减生猪养殖系统中ARGs丰度可从以下几个方面入手：从源头控制并且加强用药监督；在饲料中添加抗生素替代品（如益生元、有机酸、抗菌肽和杆菌肽）改善肠道健康，使生猪保持良好的肠道菌群；通过接种疫苗，刺激宿主利用自然防御系统产生免疫力来保障成本和免疫疾病[12，15-16]。

1.2 生猪养殖环境中抗生素及抗性基因分布

养猪场废水的排放导致环境中ARGs丰度和多样性增加，进而影响地表水和土壤中微生物生态[3]。养猪废水的抗生素含量与饲料、喂养模式、养猪场的规模以及养猪场的地理位置有关。生猪肠道吸收抗生素的能力较差，抗生素常以粪便形式进入生猪养殖环境[17]。猪粪中富集的抗生素，如土霉素含量高达5 175.3 μg/kg，远高于饲料中的含量（152.7 μg/kg）[18]。

养猪废水中的ARGs，除了环境中已经携带ARGs的微生物，其余均来源于养猪场内生猪体内的微生物。生猪养殖环境中残留抗生素又会造成选择性压力，诱导微生物发生突变，使不含ARGs的微生物产生耐药性。养猪场内的ARGs的分布如表1所示，在养猪场内能够检测到大量的ARGs，其中主要是四环素类ARGs（tetO、tetM、tetC和tetQ）和磺胺类ARGs（sul1和sul2）。ARGs广泛分布于猪舍的各个位置，甚至地下水中也能检测到ARGs的存在。在丰度方面，Gao等[19]调查养猪场内井水耐药基因丰度，其平均值高达5.27×107copies/L。这些耐药基因会随着废水水平基因转移到受纳环境中。Mu等[20]调查了北方某养猪场附近的土壤，发现磺胺类ARGs（1.3×109～2.6×109copies/g）在ARGs中最普遍，占总样本约70%。养猪场空气中生物气溶胶也含有大量致病菌和潜在ARGs宿主，这些生物气溶胶可远距离传播到外部环境，对公众健康带来重大潜在风险[21]。

表1 生猪养殖环境中ARGs分布情况Table 1 Distribution of ARGs in swine breeding environment

生活在养猪场环境中的工人肠道微生物菌群失调风险较高，可能影响人体健康。据报道，相对于肉鸡养殖场，生猪养殖户粪便中ARGs含量更高[22]。生猪养殖废弃物的不规范处理和排放将导致周围水、土壤和大气等环境受到严重污染。特别是ARGs这种不同于其他化学污染物的特殊污染物，一旦产生，很难控制和清除，并且ARGs在养猪环境中具有可持久性、会在环境中发生迁移和转化，具有比抗生素更严重的危害性。

2 不同废水处理工艺的耐药基因迁移

当前我国生猪废水传统处理设施（如格栅、固液分离机、沉淀池、序列间歇式活性污泥反应器、人工湿地等），未应用于处理抗生素耐药基因和抗生素耐药细菌（antibiotic resistant bacteria，ARB）[25]，处理后废水仍含有各种ARGs和ARB，尤其是规模化养猪场废水处理后，其ARGs需要引起足够关注。这些传统设施由于水力停留时间较短，以及生物生长和遗传交换会导致ARGs进一步增殖。大部分污水处理厂处理的废水仍存在微生物密度过高以及抗生素残留等特点，通常能检测到较高水平的β-内酰胺类、大环内酯类、多药类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等常见抗生素[26-27]，这会促进基因水平转移和抗生素耐药性产生。我国养猪废水主要处理方法为生物处理法，其次还有物理化学法和人工湿地法，这些方法对于抗生素及耐药基因的去除效率和作用机制均不同。

2.1 生物法处理抗生素及耐药基因

生物处理法是通过厌氧和好氧单独或结合使用对养猪废水进行处理，该方法可以有效处理常规污染物，如有机物（以化学需氧量（COD）形式表示）和总氮。然而，厌氧处理工艺不但不能完全去除养猪废水中的抗生素和ARGs，甚至可以为ARGs产生和转移创造有利条件[28-29]。生物处理反应器中ARGs的丰度变化受到抗生素种类、浓度和暴露时间的影响，但经过反应器后ARGs不但不会减少，甚至在抗生素暴露下大部分污泥和废水中ARGs丰度上升。厌氧处理养猪废水后，四环素类ARGs（tetA、tetG、tetC、tetM）和磺胺类ARGs（sul1、sul2）相对丰度增加[30-31]。Zhang等[29]研究发现，厌氧消化污泥中除blaTEM减少外，其他类型ARGs丰度均有不同程度增加。厌氧反应器对于养猪废水ARGs去除效率较低，但可以通过提高温度、使用添加剂提高厌氧反应器中ARGs的去除率[32-34]。Tian等[34]将厌氧反应器中温度从35°C提升到55°C时，发现13个ARGs可能宿主的18个细菌属的总丰度从23.27%下降到11.92%。Sun等[32]通过在厌氧反应器中添加生物炭刺激厌氧消化过程，降低了ARGs丰度。

厌氧和好氧结合使用有助于消减废水ARGs丰度。厌氧缺氧/好氧和厌氧短程硝化反硝化能有效降低养猪废水ARGs的绝对丰度和多样性[2]。Yang等[35]在厌氧/好氧（anaerobic/oxic，A/O）过程中检测到大量的磺胺类和四环素类ARGs（105～109copies/mL）。Sui等[36]从养猪场的A/O罐中检测到11种ARGs，包括四环素类、磺胺类和β-内酰胺类耐药基因，这些基因中sul2和sul1在厌氧池和好氧池中的丰度最高，分别达到109和108copies/mL，并且其去除量高达103.43copies/mL。结合厌氧好氧处理，我国台湾地区6个养猪场污水处理系统中ARGs平均去除率为33.30%～97.56%[37]。此外，增加水力停留时间会减少A/O处理工艺对ARGs的去除效率，Sui等[38]将养猪场废水通入序批式膜生物反应器，水力停留时间从12 d增加到30 d，其ARGs去除量从102.91copies/mL减少到101.18copies/mL。

传统的生物处理方法能耗高、运行成本高、剩余污泥处置困难，对于ARGs去除效率不理想，但目前国内养猪场大部分采用生物处理方法，需要研发出新技术或结合其他处理技术共同消减养猪废水中的ARGs。Li等[39]对比活性污泥法和微藻处理法中sul1基因的丰度，发现活性污泥法和微藻法中sul1丰度分别为3.06×107和1.73×106copies/L，该微藻处理中ARGs丰度大幅度减少。因此今后可以使用微藻处理法，该方法去除ARGs更有效，且具有能量需求低、高碳中和的能量转换能力。

2.2 物理化学法处理抗生素及耐药基因

养猪废水常用的物理化学法有消毒、膜分离、絮凝或芬顿氧化等。养猪废水处理中的消毒技术常使用紫外线消毒和氯消毒。紫外线消毒机制主要分为直接和间接2种机制，直接机制是紫外线直接穿透细胞壁、细胞膜和细胞质被核酸吸收；间接机制是细胞内的光敏物质吸收紫外线产生活性氧，氧化细胞膜、细胞质和核酸，从而杀灭细菌。理论上紫外线消毒是一种去除ARGs的可行方案，但在养猪废水处理系统使用紫外线对ARGs去除效率较差[40]。如 Ferro等[41]使用紫外线/H2O2体系处理 ARGs，240 min后其丰度仅从初始5.1×104copies/mL减少到4.3×104copies/mL。同时有研究表明，去除ARGs所需紫外线的剂量约为常规污水处理厂处理废水所需紫外线剂量的2倍[42-43]。氯消毒是通过次氯酸分子氧化水中污染物，从而达到降解的效果，但也不能彻底去除养猪废水中的 ARGs，Mao 等[44]检测了中国北方的2个污水处理厂出水口处ARGs丰度，发现经过氯消毒处理后，出水中依然存在相当浓度的ARGs（103～106copies/L）。而对于膜分离的处理方法，对ARGs去除效率较高，Liang等[45]对养猪废水进行超滤和二级反渗透的集成膜过滤，通过过滤可减少99.79%的ARGs（从3.01×108copies/mL降低到6.45×105copies/mL）。电化学消毒方法中的电凝法和电芬顿法也可以用于ARGs的去除，其通过铁或铝阳极在电解池中氧化生成混凝剂，并与细菌或污染物形成絮状沉淀物。Chen等[46]利用连续电絮凝和电芬顿法对细胞内和细胞外ARGs的去除量分别为102.49和103.23copies/mL。此外，还可以利用金属能破坏细胞结构的机理，进而去除养猪场内ARGs，Zhang 等[47]发现养猪废水 ARGs丰度为105.78～108.77copies/mL，废水通过mFe/nCu工艺处理在60 min内ARGs去除量为102.4copies/mL，并且该工艺去除ARGs的原理是杀灭细菌和破坏ARGs结构和功能，该过程对于ARGs的去除是永久不可逆的。

由此可见，减少养猪废水中ARGs，不能只使用简单的消毒方式，还应找出高效便捷的处理措施，使其处理方式达到最优状态。膜分离方法和金属破坏细胞方法虽然去除效率较高，但是所需成本高昂并且二次污染问题严重，与前2种方法相比，电化学方法尽管耗能较高，但它是最具有前瞻性、环保性的方法，是一种很好的用于去除ARGs的化学方法。

2.3 人工湿地处理抗生素及耐药基因

湿地技术是一种自然过程，具有运行和维护费用低廉的优点，自20世纪60年代以来被用于各种污水处理中，最初人们利用植被覆盖的天然湿地来处理农村或畜禽养殖污水，现已发展为利用人工模拟生态系统建造污水处理系统[48-49]。不同类型湿地对抗生素去除效率不同，例如，水面人工湿地对养猪废水中磺胺甲嘧啶（1.5 g/L）的去除率为40%，水平潜流人工湿地对其去除率为59%，垂直潜流人工湿地对其去除率为87%；而流入四环素（0.86 g/L）时，水面人工湿地对其去除率为92%，水平潜流人工湿地对其去除率为92%，垂直潜流人工湿地对其去除率为99%[50]。四环素和磺胺类抗生素的去除率不同是因为其物理化学性质不同。Carvalho等[51]在微观层面上评估人工湿地对抗生素的降解，芦苇的种植与否对四环素的降解率的影响有显著性差异。虽然不同模式下的人工湿地对抗生素的去除效率不同，但均主要通过吸附作用进行去除。

ARGs的去除受到人工湿地中植物、基质、微生物等组分的影响[52-53]。通过复合型立式流人工湿地对养猪场废水中的四环素类抗生素及耐药基因，去除率分别为95.0%和95.1%[54]。Liu等[55]通过添加火山石的垂直流人工湿地对四环素类ARGs去除率达到50%。Chen等[56]将混合人工湿地与人工曝气相结合，对ARGs特别是四环素类和磺胺类ARGs，去除效率达到97.8%～99.1%，具有比传统污水处理厂中更高的ARGs去除率。Abou-kandil等[57]研究表明，凝灰岩填充芦苇、凝灰岩填充芦苇-香蒲和砾石填充人工湿地对污染物中的总ARGs去除能力分别为89.9%～94.7%、74.3%～76.9% 和 79.7%～85.3%。最近研究发现，底物系统（沸水、砾石、红砖和牡蛎壳）不同，ARGs去除效率也不同，其中砾石对于ARGs去除效率（48%）高于其他基质体系（34%～45%）[58]。因此，采用人工湿地处理养猪废水中ARGs需要选择合适的基质体系，或将人工湿地与人工曝气相结合，或与其他生物处理技术相结合，以获得高效的去除效率。

3 养猪废水受纳环境ARGs差异分析

ARGs从动物养殖场向周围环境的传播已引起国内外学者广泛关注。养猪场的污水处理系统能够去除一部分ARGs，然而大多数抗生素和ARGs会在出水中残留，不同养殖规模、受纳环境及季节影响ARGs的检出。研究发现，在养猪场附近的水域中检测到抗生素的存在，例如，Zhou等[59]研究发现，广西某养猪场周边环境中，包括地下水、泻湖废水、沉积物中均发现抗生素的残留，其中在泻湖废水中检测到17种抗生素，其存在的质量浓度在4.36～8 600 ng/L。ARGs还能在不同介质中传播，具有比抗生素更严重的危害性[60]。ARGs会随生猪养殖场排放的废水进入到受纳水体（湖泊、河流、井水和地下水）和农田中[61-62]。Fagervold等[63]证实，有机物的输入可驱动河流中微生物群落的迁移，养猪废水会影响受纳河流中ARGs丰度，废水中高浓度营养物质和抗生素能促使受纳河流中细菌群落发生转移。

在水环境中，ARGs可通过细菌或可移动遗传元件传播，废水的排放增加了受纳环境ARGs的丰度和多样性，从而影响地表水和土壤中的微生物生态。ARGs同样存在于周围河流中，如Yang等[64]在养猪场周边河流中采集水样，检测到养猪废水中的23种基因。He等[3]研究发现，养猪场出水沟处ARGs浓度高于其排放点和下游站点，并且从上游到下游呈下降趋势；ARGs的组成与对照河段的差异较大，但与养猪场废水中的ARGs的组成相似；与对照水库相比，受纳河流中的ARGs更具有多样性；而养猪废水中的ARGs也比养猪场的井水更具有多样性，养猪废水的排放会改变受纳水体的细菌群落。在丰度方面，Yuan等[65]调查了武汉某养猪场及其周围河流ARGs存在情况，发现受纳河流中ARGs的平均丰度在 3.1×104～7.1×108copies/mL。 受 纳 环 境 中ARGs丰度受到季节的影响，如Ben等[23]研究发现夏季和冬季时附近湖泊的ARGs的平均相对丰度在0.094～0.170和0.021～0.059 copies/16S rRNA，冬季的丰度更高，这是因为冬季频繁使用抗生素治疗疾病导致生猪肠道细菌的耐药水平更高。

养猪场附近的农民常将废水使用到农田以促进蔬菜的生长[66]，但这会增加农田土壤和径流中的ARGs含量[31，67]。Gao等[68]调查中国南方某养猪场，其将未处理的废水直接用于蔬菜种植农田，在该养猪场废水排放的农田中监测到17种ARGs亚型，主要是磺胺类ARGs，其次是四环素类ARGs。最终食用蔬菜可能会对人类健康构成威胁。在养猪场附近水体和土壤均能检测到ARGs，同样说明养猪废水是ARGs持续排放到环境中的一个来源，养猪废水的排放会提高受纳水体和土壤中ARGs丰度，造成环境污染。

4 展望

生猪养殖废水是环境中ARGs的一个主要来源，受生猪养殖废水影响，各环境（水、空气、土壤）ARGs的浓度明显升高。本文重点对生猪养殖环境中ARGs从产生到进入环境的过程进行了介绍，特别是对不同养猪废水处理工艺ARGs迁移转化的差异进行了综述。在不同废水处理工艺中，生物处理方法中的厌氧工艺对于ARGs的去除率在3.5%～71%，好氧工艺甚至会增加ARGs的相对丰度，使用厌氧和好氧相结合的方式更有助于去除ARGs，而人工湿地技术去除ARGs的效率虽然高于生物处理方法，但多是吸附方式去除ARGs。基于目前的研究现状，提出未来研究的3点建议：

1）加强ARGs的源头控制、提高养猪废水处理过程中ARGs的清除效率（例如，使用益生元或优化操作条件），在保证生猪盈利能力和保护人类健康的同时，改进生猪养殖和废物管理策略，减少排放废水中ARGs的传播。

2）应强化深度处理过程。物理化学法去除ARGs具有前景性和高效性，未来ARGs的去除方法可以主要考虑物理化学法，但仍需不断优化条件以增加去除效率，同时制定养猪行业关于ARGs环境污染的相关标准，在不同工艺的污水处理环节加强对ARGs的监测。

3）建立养猪废水受纳环境ARGs预警体系，并开发出一类便携式的新型工具，其具有实用化、日常化等特性，可应用于实时测定养猪废水受纳环境中ARGs污染并提前报警。该预警体系应可防止人类因摄入含有ARGs污染的水或食物而导致抗生素耐药性在人类肠道的进一步传播。