不同感官特性酱香大曲真菌群落结构与理化特性

唐佳代，刘力萍，龙亚飞，孟卓妮，吴德光，张春林

（1.茅台学院酿酒工程系，贵州 遵义 564500；2.贵州茅台酒股份有限公司，贵州 遵义 564500）

酱香大曲以小麦、水和母曲为原料，经发酵贮存制成，在酱香型白酒生产过程中起到微生物制剂、复合酶制剂和风味物质载体等作用。依据成品曲的色泽可以分为黄曲、黑曲和白曲，黄曲皮厚，黑曲和白曲皮薄且曲心呈菊花状，黄曲呈金黄色或棕黄色，曲香浓郁；黑曲呈黑色或棕褐色，带有糊味；白曲呈麦粉色，有生麦味。制曲过程中，小麦磨碎度、拌料水分适中，入仓堆积处于发酵仓中层，溶氧较好易形成黄曲。若入仓堆积的曲坯处于发酵仓中下层，溶氧少，湿气重，水分大，曲坯发酵过程中热曲时间长则易形成黑曲。当入仓堆积时，曲坯处于发酵仓上层，门窗密封性不好，水分挥发快，热曲时间短则易形成白曲。除感官特性差异外，其糖化力、酯化力、发酵力、液化力、水分和酸度等理化指标和发酵性能存在差异。

作为微生物制剂，酱香大曲中微生物主要包括酵母菌、霉菌、细菌和放线菌，在发酵过程中产生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、纤维素酶等丰富多样的酶系，具有酒化、酯化等能力，从而促进酒中多种风味物质的形成。例如，根霉、曲霉等淀粉酶、糖化酶产生菌将小麦中的淀粉降解为葡萄糖，葡萄糖通过糖酵解途径生成丙酮酸，酵母利用丙酮酸通过糖代谢合成途径形成高级醇、乙醛、乙酸化合物等；青霉、曲霉等蛋白酶产生菌将小麦中的蛋白质降解为氨基酸，再经Ehrlich途径可产生多种-酮酸、醛和高级醇；上述化合物经辅酶催化产生乙醇、酯类等风味化合物。探究酱香大曲中真菌群落结构和多样性，以此为基础研究酱香型大曲功能真菌并应用于酿酒是目前提高酒质和生产稳定性的手段之一。

近年来，高通量测序技术因其安全性和可靠性高，能全面展现样本微生物多样性、群落结构及丰度等优势，普遍被应用于白酒领域。基于高通量测序分析不同感官特性酱香大曲中真菌群落结构，结合不同感官特性酱香大曲理化指标，分析其微生物群落结构与理化、发酵特性的关联性。同时，掌握更多酱香型白酒酿造过程中的真菌信息，以期为进一步利用白酒酿造微生物资源奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲、黑曲、白曲为贵州省仁怀市某酒厂拆仓曲，样品采集于2020年11月，该酒厂某一制曲车间中5 个曲房中的拆仓曲（黑、白、黄曲）各一块，粉碎混合后用四分法进行缩分取样，备用。

氢氧化钠（分析纯） 天津大茂化学试剂厂；硫酸（分析纯） 川东化工集团；己酸、乙醇、乙酸（均为分析纯） 上海沪试实验室器材股份有限公司；乙酸钠（分析纯） 南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1204N电子天平 上海菁海仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱、HH-8J数显恒温水浴锅常州润华电器有限公司；DK-98-II电炉 天津市泰斯特仪器有限公司；YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯医疗股份有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同感官特性酱香大曲理化特性分析

按照QB/T 4257ü2011《酿酒大曲通用分析方法》对3 种不同感官特性酱香大曲的水分含量、液化力、发酵力和酯化力进行测定。

1.3.2 酱香型大曲中DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和测序

保藏酱香大曲样品送至成都罗宁生物科技有限公司，使用Zymo Research BIOMICS DNA提取试剂盒提取黄曲、黑曲和白曲样品中的DNA。在真菌ITS区域进行扩增，扩增引物ITS3（5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR扩增用酶为KOD-Plus-Neo（KOD-401B），扩增体系为50 µL：5 μL 10hPCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTPS，3 μL 25 mmol/L MgSO，1.5 μL上游引物ITS3，1.5 μL下游引物ITS4，2 μL DNA模板，31 μL超纯水，1 μL KOD-Plus-Neo。PCR扩增条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性20 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，25～30 个循环，72 ℃延伸5 min；4 ℃保温。扩增产物纯化后用2%的琼脂糖凝胶，每个样本进行3 次重复，取线性期PCR产物等量混合后建库。进一步在Illumina HiSeq 2500测序平台开展高通量测序。

1.3.3 高通量测序数据处理与分析

高通量测序所得序列通过FLASH拼接双端序列、过滤去除低质量序列、基于Uchime算法去除嵌合体，进而得到有效数据。基于Usearch（http://drive.com/uparse/）软件，使用UPARSE算法在97%的一致性水平上进行可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类。并基于UCLUST分类法与UNITE分类学数据库（8.2）进行基因序列比对和注释分析。使用R语言（3.6.0）分析多样性和多样性。通过QIIME（v 1.9.0）软件对样品多样性指数进行分析，用于衡量多样性指标主要有Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数。其中Chao1和ACE指数用于衡量样本中物种的丰度，两者数值与样本物种总数呈正比：Chao1指数主要依据有单条或双条序列OTU数目判断物种丰度；ACE指数依据有单条序列OTU数目与出现频次低于10 次的物种衡量样本中物种总数。Shannon指数和Simpson指数用于综合衡量样本物种多样性：Shannon指数表示样本中各物种和物种间在样本中分布的均匀性，数值与物种均匀性呈正比；Simpson指数衡量样本中物种多样性，与样本多样性呈正比。使用LEfse工具（https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/Home）进行差异物种分析。

2 结果与分析

2.1 不同感官特性酱香大曲理化特性分析

酱香大曲的理化指标是衡量大曲成熟与否的重要标志，在一定程度上反映大曲品质。水分含量过低不能为微生物提供良好的生长繁殖条件，过高大曲易生霉，从而导致大曲的质量降低。酸度是微生物综合作用的结果，主要受其分解代谢产生的有机酸影响，以及脂肪和蛋白质的水解，酸度过高或过低均不利于微生物生长繁殖。液化力是衡量大曲发酵性能高低的重要指标，液化力高将为产酒、产香奠定物质基础。发酵力是反映大曲产酒能力的重要指标之一，酯化力则是反映大曲产香能力的重要指标。糖化力代表大曲中现有的酶和微生物将淀粉转化为可发酵性糖类的能力。不同感官特性酱香大曲的理化指标结果如表1所示。

表1 不同感官特性酱香大曲理化指标Table 1 Physicochemical indexes of Daqu

不同感官特性酱香大曲样品中水分质量分数分别为白曲12.89%、黄曲11.63%、黑曲12.44%，均低于13%。样品酸度由高到低依次为黑曲＞白曲＞黄曲，分别为白曲0.262 mmol/g、黄曲0.252 mmol/g、黑曲0.316 mmol/g。酱香大曲酸度范围应在0.10～0.35 mmol/g。水分含量和酸度均符合相应标准规定。酸度适宜时能够抑制杂菌生长，为有益菌提供生存环境，并作为反应物参与酯化反应。不同感官特性大曲样品液化力由高到低依次为黄曲＞白曲＞黑曲，糖化力由高至低为白曲＞黄曲＞黑曲，发酵力由高到低依次为黄曲＞黑曲＞白曲，酯化力高到低依次为黄曲＞黑曲＞白曲。表1结果与胡宝东等所测酱香大曲6 项理化指标相比均较高，该研究样品为经6 个月贮存的生产用曲，而本研究采用未经贮存的拆仓曲，酱香大曲贮存6 个月后各理化指标均有一定程度降低。6 项理化指标与张丽等研究中贮存时间为0～2 个月间的酱香大曲理化指标基本吻合。3 种大曲样品的理化指标差异主要体现在液化力和糖化力，两指标越高代表大曲对原料中淀粉转化率越高。DB52/T 871ü2014《酱香型白酒酿酒用大曲》中规定酱香大曲糖化力为100～300 U，大曲既作为糖化发酵剂，又需具备投粮、增香等作用，糖化力过高淀粉较多转化为可发酵性糖，降低投粮作用并导致起酵速度增快，堆子升温增快不利于酱香型白酒发酵。酯化力和发酵力属于大曲生化功能的动态指标，与大曲中微生物多样性及其代谢有密切联系。综合来看，黄曲各项指标更符合实际生产要求。

2.2 不同感官特性酱香型大曲真菌多样性分析

酱香型大曲样品提取基因组DNA后，对ITS区进行测序，进行双端拼接获得到优质序列，优质序列再经过滤嵌合体后共获得386 150 条有效序列，平均长度为366 bp。

Venn图可直观展现不同感官特性酱香大曲样品中的共有OTU和特有OTU，由图1可知，3 种样品共同的OTU有273 个，黄曲样品特有的OTU为237 个，白曲样品特有OTU为135 个，黑曲样品特有OTU为203 个。

图1 酱香大曲样品Venn图Fig.1 Venn diagram showing unique and shared OTUs among different colored Jiang-flavored Daqu

OTU数稀释曲线（图2）反映了样本物种丰富度随测序深度的变化趋势，以及持续抽样下新物种出现的速率。该曲线以样本中随机抽取一定数量序列数与序列所代表的物种数绘制的曲线。图2中黄曲、白曲和黑曲样品的稀释曲线前期急剧上升，随着抽取序列的增加后趋于平缓。该结果表明抽取序列前期随着抽取序列数增加，检出大量真菌物种；当抽检超过20 000 个序列后，真菌物种不再随测序数量的增加而显著增多，表明样本测序量充分，测序结果能真实反映不同感官特性酱香大曲的真菌多样性。

图2 大曲真菌OTU数稀释曲线Fig.2 Rarefaction curve of OTU number in Daqu

在97%一致性水平上进行大曲样品多样性指数值分析，结果如表2所示。覆盖率与样本中物种被测出的概率呈正比，各样本覆盖率均大于0.98，认为测序结果能够真实反映样品物种丰度及物种多样性。在不同感官特性酱香大曲中，黄曲样品的Chao1、ACE、Shannon指数和Simpson指数均最高，说明黄曲中物种分布较为均匀且检测出物种总数最高。真菌群落多样性和真菌总数由高至低依次为：黄曲＞黑曲＞白曲。

表2 大曲真菌α多样性指数Table 2 Fungal diversity indexes of Daqu

2.3 不同感官特性酱香大曲真菌群落结构分析

如图3所示，酱香大曲样品中丰度水平前10的物种有曲霉属（）、枝孢属（）、球针壳属（）、嗜热子囊菌属（）、丝衣霉菌属（）、根霉属（）、酵母属（）、亚隔孢壳属（）、青霉属（）和粪盘菌属（）。黄曲中相对丰度超过1%有（33.84%）、（12.48%）、（11.05%）、（1.83%）、（1.78%）、（1.47%）、（1.35%）、（1.33%）和（1.25%）。白曲中丰度超过1%的包括（37.92%）、（20.71%）、（13.33%）、（2.29%）、红曲霉属（）（1.32%）、丝孢毕赤氏酵母属（）（1.22%）、（1.21%）、（1.13%）、伊萨酵母属（）（1.09%）。黑曲中相对丰度超过1%有（39.55%）、（13.64%）、（11.52%）、（2.42%）、（1.96%）、（1.44%）、（1.40%）、（1.26%）、（1.26%）。

图3 属水平上大曲真菌群落结构Fig.3 Fungal community structure of Daqu at the genus level

为探究不同大曲样品组在高丰度类群上的相似性程度，选取丰度排名前50的属，从物种和组两个层面进行聚类分析，并绘制成相对丰度聚类热图（图4），便于更直观体现不同真菌属在组间中丰度和样本间真菌多样性异同。热图中颜色代表物种丰度；纵向表示不同物种在各样品间丰度的相似情况，两物种间距离越近，枝长越短，说明两个物种在各样品间的丰度越相似；横向表示不同样品的各物种丰度的相似情况，两样品间距离越近，枝长越短，说明这两个样品的各物种丰度越相似。如图4所示，横向聚类结果显示黄曲与黑曲样品间枝长较短、距离较小，表明其物种丰度相似度较大，白曲与黄曲、黑曲间距离较大，表明其物种丰度相似度较低。

图4 属水平物种相对丰度聚类热图Fig.4 Heatmap showing relative abundance of species at the genus level

主成分分析（principal component analysis，PCA）通过将测序多维数据进行降维，直观反映所获得PC得分及变量得分，从而实现样品真菌多样性相似性可视化。如图5所示，PC1、PC2分别占80.3%、6.9%，共能解释87.2%的物种差异。黄曲与黑曲样品在PC1上距离较小，说明黄曲与黑曲样品间真菌群落结构较为相似；白曲与黄曲、黑曲之间在PC1上距离较远，说明白曲与黄曲、黑曲样品组间真菌群落结构在属水平上有较大差异。

图5 不同大曲样品真菌属水平群落PCA图Fig.5 PCA plot for fungal community structure at the genus level among different Daqu samples

LEfse分析可以进行组间类群的差异检验，找到在组间差异显著的物种，也就是对组间差异贡献大的类群。LEfSe统计结果的显著差异物种线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值分布柱状图，可展示每个组内显著富集的物种及其重要性程度。通过LEfse分析（图6），从不同感官特性酱香大曲中检出6 个真菌类群，其中属于高丰度菌属的有黑曲中的、白曲中的和。造成不同感官特性酱香大曲真菌群落结构差异的主要是、、和若干丰度较低的菌属。

图6 不同大曲样品真菌显著差异物种LDA值分布Fig.6 LDA scores of significantly differential fungi among different Daqu samples

3 结 论

采用高通量测序分析对比不同感官特性的酱香大曲的真菌群落结构，并分析与其理化特性之间的关联性。由于在曲房堆积贮存过程中温度与湿度差异，酱香成品曲表现为不同感官特性。所测不同感官特性酱香大曲样品中水分含量、酸度均符合相关标准。样品间黄曲的液化力、发酵力和酯化力均较高，液化力由高到低依次为黄曲＞白曲＞黑曲，发酵力和酯化力由高到低依次为黄曲＞黑曲＞白曲，糖化力由高至低为白曲＞黄曲＞黑曲。大曲的液化力和糖化力主要与其中细菌、霉菌及其代谢相关，发酵力和酯化力主要与酵母菌相关，继而展开3 种酱香大曲中真菌群落及多样性差异分析。

通过在UNITE分类学数据库比对，结果显示在酱香大曲样品中鉴别出丰度优势真菌属：黄曲中为、和；白曲中为、和；黑曲中为、和。样品菌属丰度最高的均为，该结果与已有研究结果相印证。具有耐热和耐酸特性，在酱香大曲和酿酒环境中种类最为丰富的霉菌，可产生淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，有利于提高酒曲的液化力、发酵力和酯化力。在高丰度菌属中黄曲丰度优势真菌属与黑曲相似度较高，丰度前3的菌属相同；白曲样品的丰度优势菌属与黄曲、黑曲有一定程度差异。PCA与菌属聚类丰度热图结果表明，黄曲与黑曲样品在PC1上样品间真菌群落结构较为相似且物种丰度相似度较大；白曲与黄曲、黑曲样品组间真菌群落结构在属水平上有较大差异，且物种丰度相似度较低。为探究3 种不同感官特性酱香大曲中真菌群落结构差异，应用LEfse分析进行组间类群的差异检验，找到组间差异显著的物种。LEfse分析结果显示，造成不同感官特性酱香大曲真菌群落结构差异的主要是、、和一些丰度较低的菌属。与酒曲酒化力、发酵力与酯化力息息相关，初步判断在优势菌属同为条件下，所造成菌属差异是造成黄曲和黑曲酒化力、发酵力与酯化力较高的主要因素，发酵过程能够产生较多的醇类、酯类和醛类等风味化合物，而黑曲本身的焦糊味较重，大量投用不利于白酒风味，故在生产中投用黄曲比例最大。、和等在大曲样品中丰度较高菌属可产生阿魏酸酯酶、-淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等生物活性酶类，促进白酒中风味成分和健康因子的生成与富集。

基于高通量测序技术结合理化指标分析，初步探究了不同感官特性酱香大曲理化特性差异与真菌多样性与群落结构差异间的关联性。进一步将完善不同感官特性酱香大曲中微生物组学与风味组的相关性研究，获取酱香大曲中功能微生物，为提高酱香大曲发酵性能奠定理论与物质基础。