基于网络药理学探讨侗药血水草活性成分抗肿瘤的作用机制*

梁 沛 胡芷茵 杨翠玉 周小强 周永涛 周 群

湖南医药学院，湖南省怀化市 418000

肿瘤被认为是全世界的医学难题之一，一直以来肿瘤疾病对人类的身心健康造成着严重的危害。肿瘤疾病有着发病机制复杂、治疗效果差及复发转移率高等一系列问题。由世卫组织公布的全球癌症报告数据显示，全球癌症患者和死亡病例每年都在呈上升趋势，肿瘤疾病被认为是人类死亡的重要因素之一[1]。一直以来天然产物在抗肿瘤方面具有一定的潜力与优势[2]，随着中医药在临床实践的应用，其在治疗肿瘤疾病方面取得的作用不断突显。血水草(Eomecn chionantha Hance)为罂粟科多年生草本植物，侗药地方名为娘嫩帕(Nyangt naemx padt)主要分布于湖南、广西、贵州交界的山区地带，是侗族地区特有的药用植物，侗药血水草常生于沟边或低平湿地，其形态为多年生草本，含红黄色汁液，根状茎横生，叶基生，具长柄；叶片卵状心形；花瓣4个，白色；果实为朔果，种子多数。侗族人常用于跌打损伤、毒蛇咬伤、便血痢疾等疾病的治疗。现代研究表明，血水草活性成分主要为生物碱类，包括血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱等活性成分[3-4]，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用。目前侗药血水草在抗肿瘤方面的研究不多，作用机制尚不明确。本研究主要基于网络药理学的方法，挖掘与预测侗药血水草活性成分与抗肿瘤靶点之间的联系，构建药物成分—关键靶点—通路之间的相互作用网络，揭示侗药血水草抗肿瘤的作用机制，从而为侗药血水草在治疗肿瘤疾病方面提供新的研究思路及依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件 TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)； SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards 数据库(https：//www.genecards.org/)和Draw Venny Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)； STRING(https://string-db.org/)；生物信息注释数据库(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)；软件：Cytoscape3.7.1和R语言。

1.2 活性成分、药物及肿瘤相关基因的筛选 TCMSP数据库根据口服生物利用度(OB)≥25%、类药性(DL)≥0.18的标准验证前期从侗药血水草中分离得到的生物碱类化合物是否具有药效活性。利用PubChem 数据库在搜索框内分别输入4种化合物的英文名称，获得4种化合物的化学结构式和canonical SMILES 结构式输入 SwissTargetPrediction 平台预测化合物的相关基因。以 “tumour”为关键词在GeneCards 数据库中搜索肿瘤相关靶点基因。使用Venny2.1.0软件获取两者的交集靶点基因，即为化合物作用于肿瘤的交集靶点基因。

1.3 PPI网络构建及Hub基因筛选 运用 STRING数据库，选用 Multiple proteins工具，限定物种为人，获取化合物与疾病的交集靶点基因的蛋白互作网络(PPI)，将其保存为TSV 格式文件。应用Cytoscape3.7.1软件对TSV格式文件内容进行可视化的分析，且通过“Network tools”进行网络拓扑参数分析，以节点BetweennessCentrality，ClosenessCentrality，degree 值均大于三者中位数作为Hub基因的筛选标准， Cytoscape3.7.1软件构建“药物成分—关键靶点—疾病”三者的相互关系网络。

1.4 GO生物功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID6.8数据库对Hub基因进行GO生物功能 和 KEGG 通路富集分析，以P<0.05 为筛选条件。 在DAVID的Functional Annotation模块进行富集分析。选择物种参数为homo sapiens，标识符参数为official gene symbol，列表类型参数为gene list，其余参数为默认值。获得生物过程(BP)分子功能(MF)和细胞组分(CC)的富集结果。同时KEGG通路富集分析，得到药物治疗肿瘤的显著富集信号通路。

2 结果

2.1 活性成分及靶点预测前期通过分离侗药血水草得到了的4个生物碱类活性成分血根碱、原阿片碱、别隐品碱、白屈菜红碱，在TCSMP数据库中进行药效活性筛选，结果为这4个化合物都符合要求(表1)。药物靶点预测数据库获得4个活性成分的靶点共计239个，疾病靶点预测数据库获得肿瘤对应的靶点为9 910个，两者取交集得到199个交集基因(见图1)。

表1 活性成分参数列表

图1 化合物与肿瘤靶点的venn图

2.2 PPI网络构建及hub基因 将交集靶点导入STRING数据库中得到PPI网络，其中相关节点有PTGS2、PTGS1、BTK、SIRT1、BCL2、MTOR、MAPK8、CHEK1、AR、HCRTR2、DRD2、AGTR1等，并对其进行网络分析，筛选得到Betweenness Centrality(0.002 1)，ClosenessCentrality(0.442 4)，degree(15)3个拓扑参数均大于所有节点中位数的靶点共计66个，即为网络的Hub节点(关键基因)，其中主要的节点有HSPOAA1、MAPK1、MTOR、SRC、PIK3CA、SIRT1、PTGS2、CSNK2A1、SLC9A1、TYMS，这些基因可能是对肿瘤起主要治疗作用的靶点(Degree值排名前十的靶点，如表2所示)。然后将筛选后得到的靶点利用Cytoscape 3.7.1 软件，构建血水草活性成分治疗肿瘤“成分—靶点—疾病”网络图，并进行可视化分析，结果反映血水草活性成分对肿瘤的治疗作用与HSP90AA1等基因密切相关。

表2 4种药物与肿瘤核心靶点的相关拓扑参数

2.3 GO生物功能富集分析 DAVID 数据库进行 GO 生物功能富集分析，共获得323个富集结果，利用R语言对富集结果排名前十的功能进行了可视化编辑(见图2)，其中生物过程(BP) 主要包括pro-tein phosphorylation，peptidyl-serine phosphorylation，response to drug，protein autophosphorylation等；细胞组分(CC) 主要包括cytosol，plasma membrane，mitochondrion，phosphatidylinositol 3-kinase complex等；分子功能(MF)主要包括protein binding,ATP binding，protein kinase activity，kinase activity，protein serine/threonine kinase activity等。

2.4 KEGG 通路富集分析 运用DAVID 数据库进行了KEGG通路富集分析，结果共获得了92条信号通路，利用R语言对这些通路富集的结果进行了可视化展示，这些通路主要涉及Pathways in cancer(癌症通路)、Proteoglycans in cancer(癌症中的蛋白多糖)、Neurotrophin signaling pathway(神经营养因子信号通路)、Prostate cancer(前列腺癌)等，这可能是血水草生物碱类活性成分参与发挥抗肿瘤作用的主要调控途径(见图3)。

3 讨论

Hopkin首次提出了网络药理学的概念，开启了一种全新的研究模式。网络药理学是融合生物学的研究方法，借助信息网络学、药理学、统计学等学科，构建药物—成分—靶点—疾病之间的相互关系，阐明并诠释药物多成分与疾病之间的网络关系，打开了药物与疾病研究模式的新视角[5-6]。网络药理学系统整体地揭示药物与靶蛋白作用对疾病的影响，成为发展创新药物的重要途径，具有重要的理论和实际应用价值。近年来网络药理学被应用于多种领域，尤其在中医药研究中的应用日渐凸显，在治疗肿瘤疾病的研究中也取得了广泛进展，突出了在分子层面阐明多靶点、多通路的特点[7]。中药单体在肿瘤药物方面的研发越来越受到重视，以网络药理学为契机开拓一条中药单体与疾病之间机制研究的新路径。

目前对血水草的研究发现生物碱类活性成分具有抗肿瘤活性，但具体机制还有待进一步阐明。本研究分析发现侗药血水草生物碱类活性成分发挥抗肿瘤作用的信号通路主要集中在癌症通路、癌症中的蛋白多糖、神经营养因子信号通路等，这些途径与肿瘤的发生发展直接有关。有研究报道血根碱对肿瘤细胞具有抗炎、抗氧化、促进凋亡及抑制生长的作用[8]。血根碱通过调控MMP-2、MMP-9、cyclinD、CDK4蛋白的表达，抑制胃癌细胞的增殖，降低细胞的迁移[9]，还能经MAPK/JNK途径抑制胃癌细胞增殖[10]。血根碱参与调控乳腺癌缺氧诱导通路，通过抑制MAPK/ERK/HIF-1α通路的激活抑制肿瘤的生长[11]。血根碱还能通过PI3K/AKT/MTOR通路抑制卵巢癌的发生[12]。原阿片碱在抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡方面表现出一定的优势，原阿片碱分别可以通过激活线粒体凋亡通路[13]及P53途径[14]，抑制PI3K/AKT通路[15]参与抗肿瘤细胞的生长。有报道称白屈菜红碱通过调节MMP/TIMP系统抑制NF-κB通路从而抑制人前列腺癌细胞的增殖和转移[16]，且盐酸白屈菜红碱通过PI3K/AKT/MTOR/BAD信号通路引发线粒体凋亡达到抑制HeLa 细胞增殖的作用[17]。目前别隐品碱抗肿瘤的研究国内外文献报道甚少，可在网络药理学分析的基础上进一步展开新的研究。由此可见血水草生物碱类活性成分在抑制肿瘤细胞的生长、迁移方面主要与MAPK、PI3K通路、线粒体凋亡通路有着密切的联系，也是目前研究较多的方向。

另外，本研究对血水草活性成分进行检索分析，运用网络药理学方法共收集到活性成分的靶点239个；疾病靶点9 910个；药物成分和疾病的交集靶点199个，活性成分和肿瘤的关键核心靶点有HSP90AA1、MAPK1、MTOR、APP等。其中有研究指出HSP90AA1可作为预测癌症发生和转移风险的指标[18]，提示HSP90AA1是在肿瘤发生过程起着重要的作用。APP 在癌细胞中过表达，与DR6结合可启动坏死凋亡途径导致肿瘤细胞外渗和转移[19]。MAPK1和MTOR可调节细胞的生长、存活、代谢、分化、蛋白质合成等多种生物学过程，在癌症的发生发展中起到了关键作用[20-22]，有研究已经证实血水草生物碱类活性成分通过调控MAPK、MTOR抑制肿瘤细胞的生长。但是目前血水草生物碱类活性成分通过调控HSP90AA1、APP参与癌症发生的相关研究还较少，我们可以通过对关键核心靶点进行深入研究，进一步探索在抗肿瘤方面的机制与作用。

通过对侗药血水草抗肿瘤作用的网络药理学研究分析发现，血水草生物碱类活性成分通过多靶点、多通路发挥抗肿瘤的作用，为下一步实验验证血水草活性成分抗肿瘤作用机制提供科学理论依据与新思路，同时为民族药的药理机制研究提供新的方向。