鸢尾甲苷B对氧糖剥夺/复氧损伤PC12细胞的神经保护作用

周 密，陆 瑶，刘惠霞，陈明惠 ，郑梅竹

(1.长春师范大学生命科学学院，吉林 长春 130032；2.长春师范大学中心实验室，吉林 长春 130032)

脑卒中(Stroke)是一种严重的神经退行性疾病，有较高的发病率、致残率和致死率[1-2]。特征是氧气供应不足和血流恢复受阻，脑内神经元因缺血再灌注损伤而突然死亡。脑卒中与氧化应激、Ca2+超载、细胞凋亡、炎症反应、神经元兴奋毒性和能量代谢失衡等多种病理过程紧密相关[3-6]。这些情况相互作用和重叠，形成恶性循环，导致不可逆转的持续性神经功能障碍。中风发生时，脑内的血液供应出现阻碍或出血，导致大脑功能迅速丧失，造成脑内神经元的不可逆转性损伤。

PC12细胞来源于大鼠嗜铬细胞瘤，具有类似神经细胞的特性，被广泛应用于体外神经系统损伤研究[7]。连二亚硫酸钠是一种氧结合剂，加入液体培养基中可以短时间内结合培养基中的氧气，造成细胞低张性缺氧，且操作简单、起效快，安全稳定，能够准确反映体内细胞的缺血缺氧损伤情况[8]。到目前为止，脑卒中的治疗策略仍是有限的。本文利用PC12细胞建立细胞模型，采用化学性缺氧，在培养基中加入连二亚硫酸钠(Na2S2O4),旨在探讨天然产物射干中鸢尾甲苷B (Iristectorin B)对氧糖剥夺(OGD)以及复氧诱导的PC12细胞损伤的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.1.1 药品

PC12细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所)；鸢尾甲苷B(上海源叶生物科技有限公司)；依达拉奉(济南中科化工有限公司)；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)(Sigma公司)。

1.1.2 试剂

DMSO(Sigma公司)；DMEM培养基(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco公司)；LDH检测试剂盒、ROS检测试剂盒、Ca2+检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器

NIS-ELEMNT BR型图像分析系统(日本Nikon)；EXL808型酶标仪多功能细胞读板器(美国伯腾)； Olympus BX51光学显微镜(日本Olympus)。

1.2 PC12细胞培养

PC12细胞培养于含10%胎牛血清、含1%的青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中,5% CO2、37℃培养箱内培养约3～4 d。待PC12细胞生长到贴壁约70%～80%时用0.25 %的胰蛋白酶进行消化传代。将其制成细胞计数约1×105个/L的细胞悬液后，以每孔100 μL为准接种于96孔板, 继续于5% CO2、37℃条件下培养1～2 d ,待细胞密度达到80%～90%即可用于后续实验。

1.3 氧糖剥夺/复氧(OGD/R)离体脑卒中模型的建立及实验分组

为探究天然异黄酮鸢尾甲苷B对OGD/R处理损伤后PC12的保护作用，将上述处理后的PC12细胞分为：模型组(M)：加入含10 mmol/L Na2S2O4的无糖EBSS溶液100 μL，作用2 h，换为正常培养基复氧，继续培养24 h构成诱导OGD/R损伤模型，以模拟缺血性脑损伤。对照组(C)：不经OGD/R损伤处理。药物组(分别为处理D、Z、G)：在OGD/R的基础上分别加含鸢尾甲苷B 6.25、12.5、25 μg/mL的正常培养液复氧 24 h。阳性组(Y)：在OGD/R的基础上加10 mmol/kg依达拉奉作为阳性对照。

1.4 评价指标及方法

1.4.1 形态学观察

加入处理因素，继续37℃孵育48 h后, 在倒置显微镜下观察上述处理组的PC12细胞形态学改变情况。

1.4.2 MTT法测细胞活性

药物作用结束后，在避光条件下，每孔加入10 μL质量浓度为5 g/L的MTT于96孔细胞培养板中，5% CO2、37℃条件下继续孵育3～4 h后弃去上清，每孔加入100 μL DMSO，低速振荡10～15 min后，用酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度，实验重复3次，数据做统计分析。

1.4.3 PC12细胞中Ca2+含量检测

药物作用结束后，用装载2.5 μmol/L Fluo-3AM荧光探针的培养液与细胞在5% CO2、37℃条件下继续孵育1 h，经过适当洗涤后，利用荧光显微镜观察钙离子产生的荧光，并用酶标仪检测，波长分别为488 nm和530 nm。同时，为排除细胞密度的影响，后续做MTT使细胞密度归一化后，计算最终PC12细胞内Ca2+含量。

其中，H为Ca2+含量，A为每孔钙离子检测值，O为相应孔MTT吸光度，B为每一个处理组MTT平均值。

1.4.4 PC12细胞中LDH释放量检测

药物作用结束后，根据LDH测定试剂盒说明书进行PC12细胞内释放量测定，依据LDH释放率的高低来评价PC12细胞的损伤程度。

其中，D为LDH释放率(%)，M为样品上清液LDH活性，C为细胞最大LDH活性。

1.4.5 PC12细胞中ROS水平检测

药物作用结束后，用装载10 μmol/L DCFH-DA探针的无血清培养液与细胞在5% CO2、37℃条件下继续孵育20 min，经过无血清培养液适当洗涤后,借助酶标仪对PC12细胞内ROS水平进行检测，计算方式与上述Ca2+含量的计算方式相同。

1.4.6 细胞凋亡检测

药物作用结束后，利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(其中Annexin V-FITC为异硫氰酸荧光素标记的磷脂结合蛋白，PI为碘化丙啶)并通过流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡情况。

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，采用t检验确定显著性水平，若P<0.05，则具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 PC12细胞形态学变化

PC12细胞经Na2S2O4处理2 h后，于倒置显微镜下可见模型组的细胞损伤，与对照组相比细胞突触减少，形态固缩成圆形，细胞数量显著降低(图1 a,b)。当鸢尾甲苷B或者依达拉奉存在时, 细胞恢复原有形态,细胞损伤有所改善，活细胞数目增多(图1 c,d,e,f)。

(a)处理C (b)处理M (c)处理Y

(d)处理D (e)处理Z (f)处理G图1 各组PC12细胞形态学变化

2.2 鸢尾甲苷B对细胞存活率影响

如图2所示，模型组PC12细胞存活率明显低于正常细胞组(P<0.01)；与模型组比较，鸢尾甲苷B 12.5 μg/mL、25 μg/mL剂量组细胞存活率有明显提高(P<0.01)。图中,**表示与正常组细胞比较，P<0.01;#表示与模型组比较，P<0.05;##表示与模型组比较，P<0.01。下同。

2.3 鸢尾甲苷B对细胞内Ca2+含量影响

如图3所示，模型组PC12细胞内Ca2+含量明显高于正常细胞组(P<0.01)；与模型组比较，鸢尾甲苷B 25 μg/mL 剂量组Ca2+含量有所降低(P<0.01)。

图2 鸢尾甲苷B对PC12细胞存活率的影响 图3 鸢尾甲苷B对PC12细胞内Ca2+ 含量的影响

2.4 鸢尾甲苷B对细胞内LDH释放量影响

如图4结果显示，模型组LDH释放量明显高于对照组(P<0.01)；与模型组比较，鸢尾甲苷B 6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL剂量组LDH释放量明显降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

2.5 鸢尾甲苷B对细胞内ROS水平影响

如图5结果显示，模型组ROS水平明显高于对照组(P<0.01)；与模型组比较，鸢尾甲苷B 12.5 μg/mL、25 μg/mL剂量组ROS水平明显降低(P<0.01)。

图4 鸢尾甲苷B对PC12细胞内LDH释放 图5 鸢尾甲苷B对PC12细胞内ROS水平的影响

2.6 鸢尾甲苷B对细胞凋亡影响

如图6流式细胞凋亡图和图7结果显示，对照组的细胞凋亡率为3.6%，模型组的细胞凋亡率为 22.17%，经过OGD/R后，PC12细胞凋亡比例明显高于对照组。鸢尾甲苷B 6.25 μg/mL处理组细胞凋亡率为14.89%，12.5 μg/mL处理组细胞凋亡率为9.5%，25 μg/mL处理组细胞凋亡率为7.77%，依达拉奉阳性处理组细胞凋亡率为6.35%，药物组和阳性组与上述两组相比细胞凋亡率有显著降低。

(a)处理C (b)处理M (c)处理Y

(d)处理D (e)处理Z (f)处理G图6 不同浓度鸢尾甲苷B作用后的流式细胞凋亡图

图7 不同浓度鸢尾甲苷B对PC12细胞凋亡的影响

3 讨论

脑卒中是一种严重危害人体健康的脑血管疾病，特征是发病率高、发病快、容易复发、高度致残、严重时致死，是全球范围内重要的致死性疾病之一[9]。脑卒中发生时，脑部血管会突然破裂造成出血或者血管内形成血栓阻塞血液流动，从而引起脑内神经元损伤，随后的缺血/再灌注(I/R)还将引发一系列的病理事件[10]，最终导致对脑组织和其他器官的不可逆转损伤。卒中属于难治愈性的脑部疾病，患者一般需要长期服用药物来控制病情，然而目前常用的脑保护药物主要为合成药物，如钙拮抗剂、自由基清除剂等[11]，然而长期服用合成类药物可能对患者的代谢产生影响。天然药物中有效成分的药性相对平和，可能产生的副作用没有很明显，更适合患者长期服用。因此，迫切需要开发对脑卒中有神经保护作用的天然药物。

天然药物射干[12]中主要有效成分为异黄酮类，其在预防及治疗心脑血管疾病方面具有一定重要作用[13]。其中鸢尾甲苷B(Iristectorin B)是射干中的主要活性成分之一，被认为具有许多生物活性。已有研究表明，鸢尾甲苷B具有降低血脂、血糖，抗氧化、抗动脉粥样硬化、提高免疫功能，增强抗感染能力等作用[14]，其在抗脑卒中具有潜在的研究价值，鸢尾甲苷B对脑卒中保护作用有待进一步研究。

在研究脑卒中离体实验中，多用PC12细胞建立细胞模型。PC12细胞来源于大鼠嗜铬细胞瘤，由于与中脑多巴胺神经元的共同特征，具有类似神经细胞的特性，被广泛应用于体外神经系统损伤研究[15]。脑卒中发生会引起大量神经元凋亡，Ca2+超载，LDH、ROS释放量增加等情况都与细胞凋亡[16]过程息息相关，造成脑细胞功能障碍及形态学破坏。研究结果表明，鸢尾甲苷B能显著提高细胞存活率，减少细胞凋亡数目，降低细胞中Ca2+、LDH、ROS的表达水平。目前有关鸢尾甲苷B抗脑卒中及其机制的研究还未见报道，本研究结果也为进一步研究天然药物黄酮类化合物的抗脑卒中机制以及发生发展提供了新的参考价值。