根际促生菌的筛选及其在尾矿改良中的应用

陈意超，孙晓莹，2，解智杰，2，周攀，张露，高雪莉，李东*，刘晓风

（1. 中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041；2. 中国科学院大学生命科学学院，北京 100049）

尾矿废弃地作为一种特殊的生境类型［1］，养分匮乏、结构松散、持水性差以及面斜坡陡等恶劣的特性严重制约了矿区植被恢复。如何经济有效地实现矿砂基质改良，攻克绿垦作物移栽定植困难、提高植被存活率已成为矿区生态修复所面临的紧迫任务。

当前针对尾矿改良的有效途径并不多见，主要以污泥法和客土法为主，然而这些改良方式均存在工程量巨大的缺陷［2］。利用根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）与植物的互作机制，优化基质微生物群落组成、提高植物逆境抗性、改善矿砂理化性质，为实现低成本尾矿改良和植被恢复提供了可能。以污染物降解，氮素固定和磷、钾元素的活化，吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）合成以及分泌1-氨基环丙烷羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脱氨酶为主要应用功能的植物根际促生菌已经广泛应用于障碍土壤的修复与防治中［3］。例如，石油污染土地的微生物治理，生物菌肥对贫瘠土壤的改良，抗盐、抗碱功能微生物强化植物对盐碱地的修复等。不仅如此，根际促生菌还可通过胞外络合、胞外沉淀和胞内积累等方式实现对矿砂重金属的生物钝化以降低其对植物的毒害作用［4］。另外，根际微生物作为土壤形成过程最活跃的生物成分，它在加速土壤形成和养分循环，诱导根系产生更多的分泌物，进一步改良基质性状等方面都有重要意义［5］。

千叶蓍（Achillea millefolium）是一种耐寒、耐旱、适应性强且对栽培基质养分要求较低的芳香植物，在精油提取、活性成分、医疗保健和栽培观赏等方面具有较高的研究和应用价值。然而，在中性、偏碱性金属尾矿中有机质和养分的极端缺乏成了限制包括千叶蓍在内的大多数植物定植和生长的主要原因［6］，因此，在利用根际促生菌作为核心改良措施的同时，适当补充有机质和养分同样是确保矿砂植被恢复的关键。具备多孔结构的生物炭不仅能够为极端条件下的根际促生菌提供良好的生境，其较大的比表面积与高电荷密度还能吸附矿砂中的游离重金属［7-8］。粪肥通常是矿区最为廉价的有机物料之一，它不仅能改善矿砂的物理结构，增加有机质与养分含量，提高矿砂微生物和酶活性［9-10］，与生物炭协同施用还可增强矿砂水肥保持能力［11］。本试验利用适量粪肥、生物炭、混合促生菌及其组合作为矿砂基质改良剂，采用食药兼备的经济作物千叶蓍作为绿垦植被，通过分析植株生长指标、矿砂养分含量、酶活性和千叶蓍根际微生物群落组成，重点评价根际促生菌对氮素的固定作用以及对矿砂基质中磷、钾元素的活化与利用能力，以探寻尾矿废弃地植被恢复与生态重建的替代措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

根际促生菌菌种来源：取自包头市石拐区爬榆树铁尾矿库原生植被［黄葵（Abelmoschus moschatus）、艾菊（Ginger plan）、猪毛菜（Salsola collina）、蒺藜（Tribulus terrestris）、天人菊（Gaillardia pulchella）、千叶蓍、地椒（Thymus quinquecostatus）、黄花草木樨（Melilotus suavcolen）］根际土。供试铁尾矿砂：取自包头市石拐区爬榆树铁尾矿库（N 40°48'，E 110°14'），pH 7.51，有机质含量为3.64 g·kg-1，碱解氮含量为2.85 mg·kg-1，速效磷含量为4.29 mg·kg-1，全磷含量为5.88 g·kg-1，速效钾含量为49.30 mg·kg-1，全钾含量为7.47 g·kg-1。供试粪肥：发酵羊粪，含水率为23.98%，有机质含量为49.26%，全氮含量为8.96 g·kg-1，全磷含量为4.71 g·kg-1，全钾含量为9.12 g·kg-1。供试生物炭：由四川大宇中和农业科技发展有限公司提供，主要原料为农作物秸秆，碳化温度为500~600 ℃。供试植物：千叶蓍，由中国科学院植物研究所提供。

1.2 供试培养基

溶菌肉汤培养基（luria-bertani，LB）用于细菌的分离和保藏，配方：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉12 g（液体培养基不加），pH 7.0~7.2。

高氏一号培养基用于放线菌的分离和保藏，配方：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉12 g（液体培养基不加），pH 7.4~7.6。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）用于真菌的分离和保藏，配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉12 g（液体培养基不加）。

DF（dworkin and foster）培养基以及ADF 培养基［12］用于区别具有ACC 脱氨酶的促生菌及其活性测定，DF 培养基配方：（NH4）2SO42.0 g，MnSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，柠檬酸2.0 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸钠2.0 g，溶液Ⅰ与溶液Ⅱ各取0.1 mL，蒸馏水1000 mL，琼脂粉12 g（液体培养基不加），pH 7.2。其中溶液Ⅰ：CuSO4·5H2O 78.22 mg，MoO310 mg，H3BO310 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，MnSO4·H2O 11.9 mg，以上溶解于100 mL 无菌蒸馏水中。溶液Ⅱ：FeSO4·7H2O 100 mg，将其溶于10 mL 已灭菌的蒸馏水中，充分振荡。ADF培养基：把ACC 溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含有（NH4）2SO4且预先灭菌的DF 培养基中，调节ACC 的终浓度为3.0 mmol·L-1。

多碳源低氮培养基［13］（combined carbon medium，CCM）用于分析根际菌的IAA 合成能力，配方为溶液Ⅲ：KH2PO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.8 g，Na2FeEDTA 28 mg，钼酸钠25 mg，酵母浸膏100 mg，甘露醇5 g，蔗糖5 g，乳酸钠0.5 mL，蒸馏水900 mL；溶液Ⅳ：MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.06 g，蒸馏水100 mL。溶液Ⅲ、Ⅳ分别灭菌，冷却至50 ℃左右混合后再加入生物素（5 μg·L-1）和维生素（10 μg·L-1）各0.5 mL。

Ashby 无氮培养基［14］用于初筛获取具有固氮能力的促生菌，配方：甘露醇10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO35.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.8~7.0。

NFM（nitrogen free medium）液体培养基［15］用于定量分析促生菌的固氮酶活性，配方：苹果酸5.0 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，Na2MoO4·2H2O 0.002 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，生物素10 μg，0.5%溴麝香草酚蓝5 mL，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

Pikovskaya 培养基［16］用于初筛判断和定量分析促生菌的溶磷能力，配方：葡萄糖10.0 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，（NH4）2SO40.5 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.0 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉12 g（液体培养基不加），pH 值7.2~7.4。

Александров 硅酸盐细菌培养基［17］用于初筛判断和定量分析促生菌的解钾能力，配方：MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl3·6H2O 0.005 g，CaCO30.1 g，土壤矿物或玻璃粉0.5 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉12 g（液体培养基不加），pH 7.0~7.5。

1.3 试验方法

1.3.1根际促生菌的分离筛选 适度用力抖落植物根表土，用无菌水和无菌毛刷洗涮植物根部，得到根际土壤原液，将其稀释105、106、107、108倍后，分别涂布于LB 培养基、高氏一号培养基以及PDA 培养基上，28 ℃倒置培养2~5 d 后，挑取不同类型的典型单菌落，反复纯化后4 ℃斜面保藏。

1.3.2菌株促生特性的测定 固氮能力定性与定量分析［18］：将各分离纯化后的菌株分别接种于Ashby 无氮固体培养基上，28 ℃培养并观察菌株的生长情况，确定其是否具有固氮能力；将能够在Ashby 无氮固体培养基上正常生长的菌株接种于LB 培养基内富集培养36 h 后，在无菌操作条件下，4 ℃离心5 min 收集菌体，用0.9%的生理盐水洗涤3~4 次后，重悬于NFM 液体培养基中（利用培养基本身作参比调至OD600=1），吸取此浓度的各菌悬液5 mL 于15 mL 西林瓶后密封，抽真空充氩气反复数次（≥5 次）后，用带有三通阀的注射器抽出2 mL 气体，注入等体积的乙炔（C2H2），滴蜡密封，于28 ℃，240 r·min-1水浴振荡反应培养2 h 后注入0.25 mL 30%三氯乙酸终止反应，取100 μL 气体用气相色谱法分析乙烯（C2H4）的含量。C2H4测定完成后离心破碎，通过Bradford 法测定蛋白质含量，用于计算固氮酶活性（nmol C2H4·mg-1Pr·h-1）。

溶磷和解钾能力分析［19］：将各菌株分别接种于以磷酸三钙或矿砂为磷源的Pikovskaya 培养基与以钾矿石或矿砂为钾源的Александров 硅酸盐细菌培养基中，利用未接菌处理作为空白对照，28 ℃，240 r·min-1连续培养3 d后，于12000 r·min-1离心5 min，取上清液分别用钼锑抗比色法和原子吸收火焰光度法测定可溶性磷与可溶性钾含量［20］。

1-氨基环丙烷羧酸（ACC）脱氨酶活性测定：参照孙晓莹［21］的方法，以单位蛋白含量的细菌菌体在单位时间内产生α-KA（α-丁酮酸）的量，即（µmol α-KA·mg-1Pr·h-1）表示菌株ACC 脱氨酶的活性，其中α-K A 含量测定以pH=8.5 的0.1 mol·L-1Tris-HCl 缓冲溶液稀释样品至0.025~0.300 µmol·mL-1于540 nm 处测定的吸光度值；细胞破碎液中总蛋白含量采用Lowry 法测定。

吲哚乙酸（IAA）合成能力分析：参考Glickmann 等［22］的方法，将各根际促生菌按5%的体积比接种到含有1 g·L-1NH4NO3和100 mg·L-1L-色 氨 酸 的CCM 液 体 培 养 基 中，于28 ℃，240 r·min-1连 续 培 养3 d 后，利 用Salkowski 法测定培养液上清液的IAA 含量。

种子萌发试验：参照孙晓莹［21］的方法，挑选外观一致、大小均匀、成熟饱满的千叶蓍种子进行表面消毒（70%酒精浸泡5 min，无菌水冲洗3 次），每50 粒为1 组，均匀放置于已灭菌且铺有3 层滤纸的平皿内，将具有潜在促生功能的菌种发酵液分别稀释至菌体浓度为103、105、107、109CFU·mL-1后取5 mL 稀释液注入平皿内将滤纸充分均匀浸湿，每个浓度设置3 个重复，以灭菌的发酵培养基做对照。在湿度90%以上的28 ℃恒温箱内持续培养7 d后，测定各处理种子萌发率、幼苗根长以及平均鲜重。

1.3.3菌株的分子生物学鉴定、拮抗效应测试及组配 参照孙晓莹［21］的方法，利用细菌DNA 提取试剂盒（北京）提取上述根际促生菌的菌体总DNA，并将其作为模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR 扩增。将扩增得到的PCR 产物移交至上海美吉生物进行16S rDNA 菌种鉴定，将测序所得基因序列提交GenBank 数据库，用BLAST 进行序列对比分析，确定菌株的分类地位。

将分离得到的高效目标菌株用滤纸片法进行拮抗效应测试，选择高效且没有拮抗效应的优良菌株组配混合促生菌液。

1.3.4矿砂改良盆栽试验 盆栽试验设9 个处理，具体处理方式见表1，每个处理重复5 盆，共45 盆，随机排列置于温网大棚内（石拐区爬榆树嘎查环境修复植物资源圃室外）。试验盆钵规格：盆口直径23 cm，盆底直径18 cm，高20 cm。所有生物炭（5 g）和粪肥（30 g）与去除杂质的矿砂（5 kg）拌匀装盆，选取长势一致的千叶蓍幼苗进行移栽，每盆3 丛，1 丛2 株，每株接种混合促生菌液0.2 mL（利用血球计数板计数法确定各菌株的菌体浓度后，再分别用灭菌LB 培养基稀释至105CFU·mL-1，并按照一定的比例混合均匀），移栽深度5 cm 左右，在千叶蓍生长期间（2018 年11 月30-2019 年7 月21 日）及时除虫、除草。此外，其他农学管理措施一致（间隔4 d 浇水1 次，每盆每次250 mL）。

表1 盆栽试验处理Table 1 The treatments for pot experiment

1.3.5测定项目及方法 收获时分别测定不同处理下千叶蓍的丛径、株高，并以盆为单位小心地从盆中取出植株，去除根际附着不紧密的矿砂，用无菌刷收集附着紧密的部分，封入无菌袋，置于冰盒带回实验室，保存于-80 ℃冰箱备用。收集完根际样品后再测定根长以及地上部和根的鲜重，植株样品于105 ℃下杀青30 min 后，于80 ℃烘至恒重（记为干重）；将盆内矿砂混匀后适量采集，用于测定理化性质和酶活性。

根际微生物样品（每组处理随机选择其中的3 个重复）交由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，其中使用到的DNA 提取试剂盒为OMEGA soil DNA kit（美国），V3~V4 区间的扩增引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），测序平台为Illumina Miseq PE300。测序序列使用美吉云平台（i-sanger）进行质量控制，对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析。

采用碱解扩散法［20］测定矿砂碱解氮（1 mol·L-1NaOH）；采用凯氏定氮法［20］测定千叶蓍植株全氮（水杨酸-锌粉）和矿砂全氮（高锰酸钾-铁粉）含量；采用原子吸收火焰光度法［20］测定植物样全钾（H2SO4-H2O2）和矿砂速效钾（1 mol·L-1NH4OAc）含量；采用钒钼黄比色法［20］测定植株全磷（H2SO4-H2O2）含量；采用钼锑抗比色法［20］测定矿砂速效磷（0.5 mol·L-1NaHCO3）含量；采用苯酚-次氯酸钠比色法［17］测定脲酶活性，以1 g 干砂24 h 催化尿素产生的铵态氮（NH4+-N）质量表示，单位为（NH4+-N mg·g-1·24 h-1，37 ℃）；采用苯磷酸二钠比色法［17］测定磷酸酶活性，以1 g 干砂24 h 催化苯磷酸二钠产生的苯酚质量表示，单位为（PhOH mg·g-1·24 h-1，37 ℃）；采用3，5-二硝基水杨酸比色法［17］测定转化酶活性，以1 g 干砂24 h 催化蔗糖产生的葡萄糖质量表示，单位为（glu.，mg·g-1·24 h-1，37 ℃）。

1.4 数据处理

采用Excel 2010 统计试验数据，方差分析采用SPSS 17.0 进行，比较不同处理各指标的平均值采用Duncan 法。

2 结果与分析

2.1 根际促生菌的筛选

从尾矿库区原生植被根际土中分离得到菌落形态存在明显不同的细菌30 株、放线菌5 株、真菌11 株，其中固氮、溶磷、解钾、IAA 合成或ACC 脱氨酶分泌能力较优的菌株有4 种（表2）。分别为具有固氮作用的KSB21；矿砂溶磷优势菌KSB1，该菌株同时具有较强的IAA 合成能力；能够有效释放钾矿石和矿砂难溶性钾的KSB2；以及ACC 脱氨酶分泌能力最强的KSB7。ACC 脱氨酶可以催化降解乙烯的前体物质1-氨基环丙烷羧酸，从而降低植物体内的乙烯含量，以避免逆境条件导致植物过度分泌乙烯抑制生长，其是反映促生抗性的重要指标。

表2 各根际促生菌的促生功能Table 2 Growth-promoting function of different plant growth promoting rhizobacteria

2.2 根际促生菌株的细胞形态特征及其分子生物学鉴定

各优势菌株的菌落形态如表3 所示，进一步利用扫描电镜观察菌株KSB1、KSB2、KSB7 和KSB21 的细胞形态（图1），发现前三者菌体特征较为相似均呈长杆状，而KSB21 菌体呈短杆状或椭圆形。同时对上述菌株进行16S rDNA 测序，并将所得基因序列提交GenBank 数据库，用BLAST 进行序列对比分析，结果显示菌株KSB1、KSB2 和KSB7 均为假单胞菌属（Pseudomonassp.）；KSB21 的16S rDNA 基因序列长度为1371 bp，为根瘤菌属（Rhizobiumsp.）。

图1 菌株KSB1、KSB2、KSB7、KSB21 的扫描电镜图Fig. 1 Scanning electron microscope of KSB1，KSB2，KSB7，and KSB21

表3 菌落形态及鉴定结果Table 3 Colony morphology and identification results

2.3 根际促生菌及其组合对千叶蓍种子萌发及幼苗生长的影响

由图2 可知，低菌体浓度（103CFU·mL-1）的根际促生菌液对千叶蓍种子的萌发率与幼苗鲜重影响较小，而高菌体浓度（109CFU·mL-1）的菌液对千叶蓍种子发芽具有抑制作用。各菌株在菌体浓度为105CFU·mL-1时对千叶蓍种子萌发促进作用相对积极，该菌体浓度下，KSB1 和KSB7 菌液处理千叶蓍种子萌发率分别达到97.50%和99.17%，显著高于对照（P<0.05），且KSB7 菌液处理的幼苗鲜重较CK 显著了增加11.12%（P<0.05）。

图2 不同根际促生菌浓度对千叶蓍种子发芽率和幼苗鲜重的影响Fig. 2 Effects of growth promoting rhizobacteria cell concentration on the seed germination rate and seedling fresh weight of A.millefolium

通过拮抗试验表明4 种菌株之间均不存在相互抑制的作用，可进行互配用于制备具有多种促生功能的混合促生菌液。将菌体浓度为105CFU·mL-1的KSB1、KSB2、KSB7 和KSB21 按照体积比为2∶1∶1∶1（COM1）、1∶2∶1∶1（COM2）、1∶1∶2∶1（COM3）、1∶1∶1∶2（COM4）、2∶2∶1∶1（COM5）、1∶2∶2∶1（COM6）、1∶1∶2∶2（COM7）、2∶1∶1∶2（COM8）进行互配组合后用于对千叶蓍种子的浸种萌发。萌发试验结果如图3 所示，COM3、COM4、COM6处理后的千叶蓍种子萌发率和根长≥2 cm 的幼苗比例均显著高于CK 和其他组合（P<0.05），表明这3 种组合对千叶蓍的生长促进作用更佳。在矿砂逆境条件下，各促生功能菌的配比需要根据实际情况进行针对性的处理，考虑到本试验矿砂速效氮含量极低且根际固氮菌所固定的氮素向植物转移的效率有限，因此盆栽试验选择了混合促生菌液中固氮菌添加比例较其他组合更高的COM4。

图3 不同根际促生菌组合处理对千叶蓍种子萌发和根长的影响Fig. 3 Effects of combination treatment of different growth promoting rhizobacteria on seed germination and root length of A. millefolium

2.4 千叶蓍根际微生物的群落组成

不同处理下千叶蓍根际微生物群落组成如图4 所示，微球菌属（Micrococcus）是千叶蓍根际环境中主要的菌属，其相对丰度明显高于其他菌属。余下的蓝细菌属（Cyanobacteria）、黄杆菌属（Flavobacterium）、糖单孢菌 属 （Saccharomonospora） 、 噬 氢 菌 属（Hydrogenophaga）、链霉菌（Streptomyces）、鞘氨醇属（Sphingomonas）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）的相对丰度较高。接种根际促生菌会显著提高假单胞菌属和根瘤菌属在根际环境中的丰度（P<0.05），施用粪肥会明显增加蓝细菌属的丰度。与BⅠCF 相比，BⅡCF 处理下蓝细菌属和假单胞菌属丰度显著提高（P<0.05），而根瘤菌属的丰度变化并不明显。

图4 不同处理对千叶蓍根际微生物群落组成的影响Fig.4 Effects of different treatment on the composition of microbial community in the rhizosphere of A. millefolium

2.5 不同改良剂对矿砂碱解氮、有机质含量及酶活性的影响

如表4 所示，与CK 相比，接种促生菌液（B）或添加生物炭（C）对矿砂碱解氮和有机质含量影响均不显著；粪肥（F）处理下的碱解氮和有机质含量较CK 分别提高了43.21%和16.24%。在添加生物炭的基础上接种促生菌液（BC）不能引起矿砂碱解氮和有机质含量的显著变化；但在施用粪肥的基础上接种促生菌液（BF）较F 能够进一步增加矿砂有机质含量，这或许是因为在此条件下，根际促生菌与千叶蓍形成良好的共生关系增加了根系分泌物导致的。利用CF 作参比，发现BⅡCF 处理矿砂碱解氮和有机质含量分别提高了8.47%和7.23%。以上结果表明，仅接种根际促生菌对矿砂养分含量的改善效果甚微，粪肥对根际促生菌的功能发挥存在至关重要的影响，生物炭、粪肥和根际促生菌具有协同作用，三者形成的复合改良剂具有进一步提高矿砂有机质含量并改善速效氮供给的作用。

表4 不同处理对矿砂养分含量及酶活性的影响Table 4 Effects of different treatments on nutrient content and enzyme activity of iron tailings

脲酶和磷酸酶活性可以表征矿砂有机氮、磷向有效氮、磷的转化和供应能力，蔗糖转化酶活性能够反映基质熟化程度。施用粪肥（F）较对照处理（CK）可显著提高矿砂脲酶、磷酸酶和蔗糖转化酶活性（P<0.05），接种促生菌液仅能够增加矿砂磷酸酶活性。各改良剂的两两组合处理下3 种矿砂酶活性均以BC 效果较差。通过比较BF与CF 两处理之间的差异可知，在施用粪肥的条件下接种促生菌液更有利于矿砂磷酸酶和蔗糖转化酶的活性提高，而在此条件下添加生物炭仅能够促进脲酶活性增加。3 种改良因子的混合处理（BⅠCF 和BⅡCF）下，矿砂脲酶、磷酸酶和蔗糖转化酶活性较其他处理存在显著增加（P<0.05），且BⅡCF 处理下的矿砂磷酸酶活性较BⅠCF 增加了6.90%，表明增加促生菌液接种量与提高矿砂磷酸酶活性呈正相关。

2.6 不同处理对千叶蓍生长的影响

丛径是以丛为单位测量同一物种不同丛植株的丛冠直径，其能反映作物的生长活力，也可作为绿垦恢复时种植密度的指导性指标。结合图5 和表5 可以看出，只接种促生菌液处理（B）对千叶蓍生长促进作用并不明显，且该处理下千叶蓍的丛径和株高较对照（CK）显著下降（P<0.05）。这可能与矿砂速效养分低有关，接种的大量根际微生物在其生长和繁殖过程中由于养分缺乏与千叶蓍植株发生了养分竞争。生物炭（C）和促生菌液+生物炭搭配处理（BC）下千叶蓍的根较为细长，分别较CK 增长了17.27%和21.86%，但生物量并未增加。这或许是因为生物炭能够吸附矿砂中的重金属，从而避免根冠生长受抑制，但其本身蕴含的养分较少难以形成茁壮的根系所致。与CK 相比，施用粪肥（F）可显著提高千叶蓍的株高和根长（P<0.05）；且含粪肥处理（BF、CF、BⅠCF、BⅡCF）的千叶蓍丛径、株高、根长、地上和地下部分鲜重均有显著增加（P<0.05）。表明粪肥对千叶蓍生长促进作用显著，在粪肥的基础上，接种促生菌液或添加生物炭对千叶蓍生长的影响更为积极。

表5 不同处理对千叶蓍生长的影响Table 5 Effects of different treatments on the growth indexes of A.millefolium

图5 不同处理对千叶蓍植株生长状况的影响Fig.5 Effects of different treatments on plant growth of A. millefolium

植株地上部与地下部的物质分配在形态上常呈一定的比例关系，在自然条件下受到水分、光照、养分、温度、激素以及人为耕作等因素的影响。而在试验条件下，影响千叶蓍生长的各因素得到控制，养分（粪肥施用与否）差异则是最可能造成该比例不同的主要原因，根系作为植物获取养分的主要器官，当养分缺乏时优先满足根系生长拓展根系范围以获取更多养分。通过比较不同矿砂改良剂对千叶蓍根冠比发现：CK、B、C、BC 处理的根冠比（0.63~0.70）显著高于养分相对丰富的F、BF、CF、BⅠCF 以及BⅡCF 处理（0.49~0.55），结果表明养分是限制千叶蓍生长的关键因素之一，而施用粪肥能够有效缓解此类现象。

2.7 不同改良剂对盆栽系统氮素总量和分布的影响

各处理以盆为单位的千叶蓍植株氮总量均较低，占比不足对应盆栽系统氮素总量的20%（图6），结合矿砂碱解氮含量（表3）可说明大部分存在于矿砂中的氮素都是植物不能直接利用的无效氮。与CK 相比，接种促生菌液（B）对千叶蓍盆栽系统中的氮素总量的影响并不明显；添加生物炭（C）会造成矿砂全氮总量和盆栽系统氮素总量的下降；两者复配形成的处理（BC）对千叶蓍植株氮总量、矿砂全氮总量以及盆栽系统氮素总量的影响均不显著。粪肥的施用会引入氮素并增加盆栽系统氮素总量，试验结果表明F 处理的盆栽系统氮素总量较CK 提高了49.36%，其中矿砂全氮总量增加了47.62%，千叶蓍植株氮总量增加了58.40%。

图6 不同改良剂对盆栽系统氮素总量和分布的影响Fig. 6 Effects of different modifiers on the total amount and distribution of nitrogen in pot system

以改良剂F 作参比，BF 显著提高了千叶蓍植株氮总量（P<0.05），且盆栽系统中的氮素总量达539.36 mg·盆-1，较F 处理增加了11.18%，表明改良措施BF 存在向盆栽系统中固定氮素的因素。蓝细菌属和根瘤菌属两个菌属下的大部分细菌具有固氮作用，通过对比图4 所示的主要根际微生物种类可知，BF 蓝细菌属的丰度水平较F处理无显著差异，但根瘤菌属丰度却增加了2.13 倍，因此可以认为盆栽系统氮素增加的原因是KSB21 定植并发挥了固氮作用。进一步比较BⅠCF 和BⅡCF 盆栽系统中氮素分布情况和总量发现，前者千叶蓍植株氮总量和盆栽系统氮素总量均显著低于后者（P<0.05），说明根际促生菌液接种量增加时，生物固氮的作用增强，同时新增氮素进入到千叶蓍植株体内。

2.8 不同改良剂对盆栽系统可利用磷、钾总量和分布的影响

磷、钾元素的自然转移相对困难，因此在盆栽系统中它们的含量较为稳定，试验过程中除施用粪肥会引起盆栽系统可利用磷、钾总量增加外，根际促生菌对难溶性磷、钾的活化作用是盆栽系统获得可利用磷、钾的另一关键途径。可利用磷、钾在盆栽系统中一部分会转移进入千叶蓍植株体内，另一部分则残留在矿砂中。由图7 可知，在单一改良措施中，粪肥施用（F）会明显增加盆栽系统可利用磷、钾总量，且显著高于接种促生菌液或添加生物炭处理（P<0.05），但后两者的混合处理（BC）对盆栽系统可利用磷总量较CK 显著增加（P<0.05）。与F 相比，BF 处理矿砂有效磷和速效钾总量分别增加9.45% 和17.11%，千叶蓍植株磷、钾总量分别增加27.40% 和33.82%，盆栽系统可利用磷、钾总量分别增加22.54%和22.00%；而在CF 处理下，仅有千叶蓍植株钾总量和盆栽系统可利用钾总量分别增加了15.61%和8.32%。以上结果说明：在均施用粪肥的条件下，接种促生菌液有利于对矿砂难溶性磷和钾两种元素的活化；而添加生物炭对矿砂难溶性磷的有效性转化却不够明显，仅在一定程度上改善矿砂速效钾的供应。

图7 不同改良剂对盆栽系统可利用磷、钾总量和分布的影响Fig.7 Effects of different modifiers on the total amount and distribution of available phosphorus and potassium in pot system

BⅠCF 和BⅡCF 处理下盆栽系统可利用磷、钾总量，无论是较CK，还是较各单一改良因子（B、C、F）均有显著（P<0.05）增加，表明3 种改良因子的混合处理具有协同作用。将BⅠCF 和BⅡCF 两者对比可知：增加促生菌液接种量对盆栽系统可利用磷、钾总量的影响不明显；却显著降低了矿砂中的速效钾总量（P<0.05）；同时增加了千叶蓍植株钾总量。这表明增加促生菌液接种量虽然不能够活化更多的矿砂难溶性钾，但能够促进已活化的钾元素从矿砂向千叶蓍植株内转移，即增强了千叶蓍对钾元素的吸收利用能力。以上结果表明：试验中接种的根际促生菌发挥了溶磷和解钾作用，且增加接种量能强化千叶蓍对钾元素的吸收。

3 讨论

养分与水分条件是限制绝大多数尾矿废弃地植被恢复的关键因素［23］，然而水分不足还可通过选育耐旱品种、投施保水剂或人工给水予以克服，但养分缺失导致的作物生长缓慢、植株矮小、甚至枯亡等问题，使得植被恢复建设更为棘手，如若大量施肥又会因矿砂基质极差的保肥性能造成大量浪费和面源污染。矿砂速效养分中氮、磷、钾的含量极低，但全磷、全钾占比较高，因此利用生物固氮、溶磷、解钾、IAA 合成以及ACC 脱氨酶分泌等作用为核心功能的PGPR 可作为实现矿砂速效养分含量增加，促进绿垦植被旺盛生长，提高作物逆境抗性最为经济有效的方式。研究表明PGPR 的菌株特性和作用方式多样［24］，对不同生境的适应性也存在差异，所以本研究从尾矿原生植被中筛选优良根际菌种资源，并特别探究了目标菌株在不添加IAA 前体物质情况下植物生长激素的产量，矿砂直接作为底物时的溶磷、解钾效果，不同菌体浓度对绿垦植物的促生情况，以及接种根际促生菌对植株根际微生物群落组成的影响，这都是以往相关研究涉及较少的［12，25］。需要指出的是具有促生作用的菌株并非在任何条件下都具有促生作用，如过高的菌体浓度对供试种子萌发存在抑制作用，且具有固氮作用的促生菌KSB21 在种子萌发过程中并未表现出显著的促进作用，可能原因是该固氮菌初期固定的氮素主要用于自身繁殖而非直接供给植物。

根际促生菌的固氮、溶磷、解钾作用会增加系统中的氮素总量以及可利用磷、钾总量，然而新增养分在基质-作物中的存在和分布受到多种因素的影响，当前较多基于盆栽系统的研究只单独分析改良剂对基质或作物养分的影响［26-27］，这种做法显然是不全面的。盆栽系统虽然不是生态恢复研究的常用参考系，但该系统能够更好地反映养分释放、转移以及流失的规律。利用该系统作比较可知，接种促生菌液（B）对盆栽系统中氮素总量、可利用磷、钾总量以及千叶蓍生长的影响较CK 并不明显，仅提高了矿砂磷酸酶活性。这与部分报道指出的益生菌（共生固氮菌、菌根真菌或根际促生菌）接种对矿砂结构改良、植株养分获取和生长发育存在积极作用是相悖的［28］。这是因为本研究中矿砂基质养分极端匮乏，可溶性碳、氮含量低，在不添加碳、氮源的情况下试验初期大量接种根际促生菌容易造成微生物和植物之间的养分竞争。一般来讲，养分胁迫存在时会优先满足根系养分需求以扩张根系范围获取更多养分，表现为根系增长、根毛长度和密度增加，植株矮化、叶面积变小，根冠比较高，尤以氮、磷胁迫明显，试验结果显示不含粪肥处理的根冠比显著高于含有粪肥的处理即可作为上述论断的支撑。

生物炭被认为是土壤微生物寄居的佳境，在影响土壤微域性状的同时可改善微生物的群落结构［29］。杨侨等［30］利用0.1%~0.3%的生物炭能够显著增加铜尾矿砂碱解氮、有效磷含量并明显提高作物生物量；刘博文［31］利用生物炭为载体制备的根际促生菌肥能够对土壤改良和作物增产起到协同增效的作用。而在本研究中，与CK相比，添加生物炭（C）对矿砂磷、钾含量和千叶蓍的生长指标没有明显改善；生物炭+根际促生菌处理（BC）较CK 仅提高了矿砂磷酸酶活性和千叶蓍根长。导致这两种结果差异的原因，可能在于本试验中矿砂养分过于贫瘠，限制了部分根际促生菌的生长繁殖和功能发挥。

粪肥可明显增加绿垦作物的丛径、株高、根长和生物量，显著提高矿砂速效养分和酶活性，这与有机肥对矿砂改良的效果存在相似性［32］。盆栽系统的引入使得营养元素的存在和转移可视化，供试粪肥因本身含有较多的植物养分，所以粪肥处理（F）盆栽系统中的氮素总量以及可利用磷、钾总量都显著高于B 和C 处理。在施用粪肥的基础上，接种促生菌液（BF）或添加生物炭（CF）对矿砂速效养分含量、相关酶活性、千叶蓍生长指标，以及盆栽系统氮素固定、难溶性磷钾活化较仅施粪肥（F）均存在一定程度的提升。究其原因，或许在于粪肥施用后，矿砂养分限制和理化结构得到改善，促生菌液和生物炭的改良、促生作用开始凸显。此外，粪肥的施用还会显著提高矿砂中根瘤菌属的丰度，其中该菌属下有120 多种菌具有固氮功能。因此，粪肥施用后盆栽系统氮素总量的增加可能来源于粪肥本身以及部分具有固氮功能的蓝细菌的固氮作用。

与BⅠCF 相比，BⅡCF 增加了一倍的根际促生菌液接种量，但千叶蓍根际微生物中根瘤菌属的丰度水平并无明显差异，其原因在于根瘤菌属是异养型的微生物，它在根际环境中的丰度受制于千叶蓍根际分泌物的产量，所以其丰度并不会因接种量的增加而提高。与根瘤菌属不同的是，蓝细菌属中的大部分蓝细菌是属于能固氮的自养型微生物。当增加KSB1 和KSB2 接种量时，可活化更多的矿砂难溶性磷、钾。这些矿质元素一部分直接供给千叶蓍，另一部分被具有固氮作用的蓝细菌吸收利用，使其丰度提高从而固定更多的氮素以表现出盆栽系统氮素总量增加现象。

4 结论

通过筛选尾矿自然条件下原生植被的优良根际促生菌并将其组配成多功能的促生菌剂，再与具有基质改良作用的生物炭和廉价粪肥结合应用是一种因地制宜且经济有效的矿砂改良和植被恢复措施。

试验条件下，上述组合改良措施中的多功能混合促生菌发挥了其中的固氮、溶磷和解钾作用，且加大混合促生菌液接种量会增加矿砂生物固氮的总量并强化千叶蓍对钾元素的吸收利用能力。单一改良措施中粪肥的施用对绿垦作物千叶蓍的生长促进效果最佳，仅接种混合促生菌液和单独添加生物炭对矿砂养分和千叶蓍的生长情况不存在明显改善作用。