线粒体质量控制失调介导卒中后认知障碍的研究进展*

陈丽敏， 白艳杰， 王 岩， 陈淑颖， 张雍闯， 李晓晓， 丁志敏

（1河南中医药大学康复医学院，河南 郑州 450046；2河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450099）

据统计，脑卒中已经成为导致残疾和血管性死亡的主要原因，其中以缺血性脑卒中最常见，并且脑卒中的发病率在年轻人群中逐渐增加［1］。约有1/3的脑卒中幸存者可能发生认知障碍，这种并发症的发病率在不断上升，但经常被人们忽视［2］。卒中后认知障碍（post-stroke cognitive impairment，PSCI）主要表现为执行、注意、记忆、语言及视空间等能力的减弱，包括从卒中后非痴呆型认知障碍到卒中后痴呆的一系列症状。目前PSCI 的发病机制尚不明确，现有研究主要集中于脑血管损伤、脑神经退行性病变、炎症反应和氧自由基损伤等机制。临床上PSCI的药物治疗主要参考阿尔茨海默病，常用胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂等防止PSCI转向痴呆，但是疗效并不显著［3］。

线粒体是高度可塑和动态的细胞器，与脑组织的缺血缺氧联系紧密，线粒体功能障碍是创伤性和神经退行性中枢神经系统疾病的发病机制之一［4］。而线粒体质量控制对于线粒体网络的稳态和线粒体功能的正常发挥有重要意义，它主要包括线粒体生物发生、线粒体动力学和线粒体自噬3 个部分。机体通过线粒体的这3 种活动可以产生新的线粒体，修复和清除受损线粒体，减少活性氧（reactive oxy-gen species，ROS）的产生，调控细胞凋亡，进而可能影响大脑海马区的功能状态［5］。因此，本文综述线粒体质量控制体系在PSCI中的作用机制。

1 线粒体质量控制的概述

线粒体生物发生、线粒体动力学和线粒体自噬相互协调，共同调控线粒体的形态、数量、周转和遗传。ROS 是线粒体和细胞代谢的副产物，过多的ROS 积聚可破坏线粒体形态和功能，受损线粒体会发生分裂和融合，同时也会促进ROS生成，线粒体分裂则会引起线粒体自噬，进而清除细胞内的线粒体碎片和ROS，当线粒体数量减少时，线粒体生物发生会被激活，以增加线粒体数量［6-7］。

1.1 ROS 调控线粒体功能 氧化应激是由生物系统中氧化和抗氧化之间的不平衡产生的一种情况，这种不平衡的发生是ROS水平过高或抗氧化系统功能不正常所造成的［8］。线粒体产生ATP 依赖于氧化磷酸化，而该过程的副产品就是ROS［9］。ROS会破坏细胞中的蛋白质和脂质，从而阻碍线粒体对细胞的能量供应。它还对线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）产生有害影响，使mtDNA 的启动子失活并下调相关线粒体基因的表达。然而，在生理情况下ROS 的生成和清除是保持平衡的［10］。ROS 过量产生的主要原因是线粒体中各种氧化还原酶富集和线粒体功能障碍，而这些功能障碍主要包括线粒体动力学紊乱、线粒体自噬异常和线粒体生物发生减少［11-13］。因此，维持线粒体质量控制体系的正常工作对ROS的动态平衡有重要意义。

1.2 线粒体动力学调控线粒体功能 在细胞中，线粒体不断分裂和融合，使线粒体处于动态平衡之中，这对线粒体稳态、细胞稳定性和细胞存活都有关键作用，因此常将线粒体分裂和融合的动态过程称为线粒体动力学。促使线粒体融合的关键蛋白有3种，分别是视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）和线粒体融合蛋白1/2（mitofusin 1/2，Mfn1/2）。其中OPA1主要介导线粒体内膜融合，而Mfn1/2主要介导线粒体外膜融合［14-15］。OPA1 由 OMA1 或 YME1L 蛋白酶进行蛋白水解，形成长式OPA1（long OPA1，LOPA1）和短式OPA1（short OPA1，S-OPA1），L-OPA1介导线粒体融合，而S-OPA1 介导线粒体分裂［16］。但随后的研究表明，YME1L 蛋白酶在S3 切割位点水解生成的S-OPA1 也能够调节线粒体融合［17］。线粒体的融合过程需要三步：（1）两个线粒体被拴在一起，并在外膜之间的接触点周围形成对接环结构；（2）两外膜由 GTP 水解，通过 Mfn1/2 融合在一起；（3）两个内膜通过 OPA1 融合［18-19］。尽管 Mfn1、Mfn2 和 OPA1对于控制线粒体融合都是必不可少的，但是Mfn1 和Mfn2之间存在功能差异。例如，OPA1的过表达可以抵消Mfn2敲除对线粒体形态的影响，但是不能抵消Mfn1缺失的影响［20］。

线粒体分裂常发生在线粒体与内质网的接触位点上，发动蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）充当主调节剂，在线粒体分裂中起核心作用，尽管发动蛋白2（dynamin 2，Dyn2）在线粒体分裂中也起一定的作用，但它对于Drp1 介导的分裂并不是必需的［21-22］。Drp1 向线粒体的募集由 4 种锚定在线粒体外膜上的受体蛋白介导：分裂蛋白1（fission protein 1，Fis1）、线粒体分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）、线粒体延伸因子 1（mitochondrial elongation factor 1，MIEF1/MiD51）和线粒体延伸因子2（mitochondrial elongation factor 2，MIEF2/MiD49）。激活的Drp1 从细胞质基质转移到线粒体膜，然后与Drp1 受体相互作用以产生分裂复合物，接着线粒体通过Drp1 寡聚化进一步收缩，Dyn2 立即被招募到收缩的位点，通过GTP水解完成线粒体的切割［23-24］。然而，近期有研究表明，Fis1不能将细胞质内的Drp1募集到线粒体表面，而另外3 种蛋白已经被确定为Drp1 易位到线粒体的主要受体［25-27］。因此，线粒体分裂和融合可以改变线粒体形态，重新分配线粒体的受损部分，进而稳定神经元内线粒体的功能。

1.3 线粒体自噬调控线粒体功能 线粒体利用其衍生的囊泡特异性地吞噬受损或者多余的线粒体，然后将其输送到溶酶体或过氧化物酶体进行降解，以维持线粒体的稳态，这是线粒体自噬的重要过程。现有研究表明，线粒体自噬分为泛素依赖型和受体依赖型，前者由PTEN 诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/parkin信号通路介导，后者由线粒体外膜上的Bcl-2/腺病毒E1B 19 kD 相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，BNIP3）、Nip 样蛋白X（Nip-like protein X，NIX/BNIP3L）和含 FUN14 域蛋白 1（FUN14 domain containing 1，FUNDC1）受体诱发［28］。其中，泛素依赖性PINK1/parkin 介导的线粒体自噬与神经退行性疾病有明显联系且得到广泛研究。在生理条件下，PINK1 作为线粒体靶向蛋白通过在线粒体外膜定位的外膜转位酶（translocase of the outer membrane，TOM）复合物和在线粒体内膜定位的内膜转位酶（translocase of the inner membrane，TIM）23 复合物导入线粒体，再由线粒体加工肽酶（mitochondrial processing peptidase，MPP）和早老素相关菱形样蛋白（presenilin-associated rhomboid-like protein，PARL）切割并逆向易位到细胞质基质进行降解［29-30］。然而，这种过程依赖稳定的线粒体膜电位，当线粒体功能失调时，PINK1 不能插入线粒体中进行降解，积聚在线粒体上并进行磷酸化，然后招募并激活E3 泛素连接酶parkin、泛素和TANK 结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），导致线粒体外膜泛素化，最后通过视神经蛋白（optineurin）、核点蛋白 52（nuclear dot protein 52，NDP52）及其泛素与自噬体的微管相关蛋白 1 轻 链 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）结合，介导受损线粒体的自我清除，维持线粒体的正常功能［31-32］。

1.4 线粒体生物发生调控线粒体功能 在线粒体生命周期中，线粒体生物发生不仅能够维持线粒体稳态，还可以满足真核细胞的生理需求。它是线粒体的一种增殖过程，常发生在线粒体功能受损之后。线粒体生物发生是一个复杂的过程，需要细胞和线粒体基因组的协调表达来调控几个不同的过程：（1）线粒体内外膜的合成；（2）线粒体编码蛋白的合成；（3）核基因组编码蛋白的合成和导入；（3）脂质导入；（5）氧化磷酸化；（6）mtDNA 的复制；（7）线粒体的融合与分裂［33］。与线粒体生物发生相关的基因表达谱包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）、核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor 1/2，NRF-1/2）及线粒体转录因子B1（mitochondrial transcription factor B1，TFB1M）。PGC-1α 是一种高度通用的转录共激活剂，是线粒体生物发生的主调节剂。PGC-1α诱导2个关键转录因子NRF-1 和NRF-2 表达并激活它们的转录，从而增加TFAM 表达和细胞内氧化磷酸化；随后，TFAM 促进线粒体编码多肽的表达及mtRNA 的复制，刺激线粒体生物发生，新生线粒体可减轻大量线粒体受损引起的能量代谢异常［34-35］。

2 线粒体质量控制体系与PSCI的关系

当机体患有缺血性脑卒中时，局灶性脑血流量的显著下降导致葡萄糖和氧气缺乏，并且可能引起海马神经元的损伤。临床上进行溶栓治疗后，堵塞血管被疏通，大脑中的供氧逐渐恢复，然而在脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）过程中，线粒体以氧气为底物，生成大量ROS，损害线粒体的功能，进而引起海马神经元的程序性死亡，导致机体出现学习记忆方面的障碍［36-37］。如图1所示。

Figure 1. The relationship between mitochondrial quality control system and post-stroke cognitive impairment（PSCI）. When stroke occurs in the body，mitochondrial damage and increase in reactive oxygen species（ROS）interact. Damaged mitochondria can fuse with normal mitochondria mediated by optic atrophy 1（OPA1）and mitofusin 1/2（MFN1/2），and also show fission mediated by dynamin-related protein 1（Drp1），fission protein 1（Fis1），mitochondrial fission factor（Mff），etc. After mitochondrial fission，severely damaged mitochondria undergo mitochondrial autophagy and degradation in phagosomes. A large number of mitochondrial fragments inhibit mitochondrial biogenesis mediated by peroxisome proliferatoractivated receptor γ coactivator-1α（PGC-1α），mitochondrial transcription factor A（TFAM），nuclear respiratory factor-1/2（NRF-1/2），etc. These changes in mitochondria lead to impaired mitochondrial number and function and the death of hippocampal neurons，which in turn cause PSCI. MIEF1/2：mitochondrial elongation factor 1/2； LC3： microtubuleassociated protein 1 light chain 3；TFB1M：mitochondrial transcription factor B1.图1 线粒体质量控制体系与PSCI的关系示意图

2.1 线粒体氧化应激参与PSCI 的发展 大脑神经元是机体耗氧量最大的细胞，当大脑缺血时，线粒体中的氧气含量下降，抑制线粒体内氧化磷酸化的过程和ATP 的生成，线粒体电子传递链（electron transport chains，ETCs）也会遭到破坏，线粒体抗氧化防御能力下降，此后大脑的再灌注会激活线粒体的有氧呼吸，利用ETCs 产生过量的ROS。在这个过程中，线粒体产生的过量ROS 会促使细胞的氧化能力超过薄弱的抗氧化能力，增强氧化应激反应，进一步导致mtDNA 被破坏、线粒体脂质过氧化、钙离子稳态被打破和线粒体膜去极化。线粒体功能的紊乱会促进细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）释放，进而促进海马神经元的凋亡［38-39］。在大鼠海马区灌注不足时，海马线粒体内抗氧化剂含量和呼吸复合酶（复合物I、II 和IV）活性下降，ETCs 产生大量ROS，Cyt C 氧化酶IV 表达减少，海马神经元大量凋亡，大鼠的学习记忆能力下降［40］。异丙酚是一种广泛使用的静脉麻醉剂，对ROS的生成具有抑制作用，在许多神经系统疾病中具有神经保护作用。Zhong等［41］向脑I/R 小鼠注射异丙酚后，观察到神经细胞内ROS含量下降，内质网钙离子释放减少，线粒体去极化减弱，线粒体和内质网的肿胀及神经元的凋亡减轻。依达拉奉是一种自由基清除剂，在I/R 过程中它能减少ROS 产生，降低线粒体内膜通透性，进而抑制神经元凋亡［42］。此外，褪黑素作为一种抗氧化剂能够抑制海马神经元中ROS生成，减轻线粒体氧化应激，维持线粒体正常功能，改善机体学习和记忆［43］。上述研究表明，线粒体ROS 的过量产生会引起海马神经元凋亡，减少线粒体ROS生成可缓解PSCI。

2.2 线粒体动力学参与PSCI 的发展 线粒体形态对于维持线粒体动力学至关重要，脑I/R 损伤后海马区神经元中的线粒体从杆状分裂成球状［44］。碎片化的线粒体可导致能量供应紊乱、氧化应激的发生以及ROS 的过度产生，ROS 的过度积累会诱导线粒体过渡孔的打开。这些病理变化随后导致线粒体膜电位受损、线粒体中促凋亡因子的释放，进一步激活线粒体依赖性凋亡途径并最终加重脑组织损伤［45］。除此之外，OPA1 促使Cyt C 维持在线粒体内膜的丝状褶皱中，当脑组织发生I/R 损伤时，海马神经元胞质中的Cyt C 含量随着OPA1 寡聚物的减少而增加，Cyt C 从线粒体膜中释放出，随后诱导海马神经元的凋亡［46］。而且，Drp1 可以提高促凋亡蛋白 Bax 的表达，增加线粒体外膜通透性和氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）海马细胞的死亡率［47］。线粒体分裂抑制剂1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）是Drp1 的变构抑制剂。一项研究对小鼠创伤性脑损伤后大脑皮质细胞的生存状态进行检测，结果显示Mdivi-1 减少了细胞的凋亡并改善了小鼠的空间记忆能力［48］。但是，许多学者质疑Mdivi-1 的特异性和有效性［49］。有实验表明，大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠海马神经元中的缺氧/缺血状态引起了Mfn2 含量下降，降低了Bcl-2/Bax 的比值，增加了 caspase-3 和 Cyt C 的释放，诱导细胞凋亡，然而Mfn2过表达可以减弱以上现象［50］。以上结果表明，脑卒中发生后，海马神经元大部分线粒体可能会出现分裂和融合的失衡，激活促凋亡蛋白，抑制抗凋亡蛋白的表达，进而促使大量海马神经元凋亡，破坏大脑的认知功能。

2.3 线粒体自噬参与PSCI 的发展 在大脑缺血期和再灌注期均观察到线粒体碎片化和分裂增强，线粒体分裂可选择性地将线粒体内的受损成分分布到某个后代中，从而导致其中一个线粒体严重受损，线粒体将会通过自噬清除掉无法参与融合的受损线粒体［51］。线粒体自噬是细胞存活的双刃剑：当脑组织I/R 损伤程度较轻，线粒体自噬适度激活，此时自噬体不仅通过降解蛋白质来提供能量，还去除受损线粒体以保护神经元；当脑组织损伤程度较重时，线粒体自噬不足以清除受损的线粒体或线粒体自噬过度使自噬系统超负荷，这两种情况都会激活细胞凋亡相关的调节蛋白，促使受损部位的神经元凋亡［52］。有研究将自噬激活剂RAP 加入到OGD 海马细胞的培养基中，观察到通过适度激活海马神经元中LC3、PINK1 和parkin 的表达，可增强线粒体自噬，从而降低神经元内ROS的水平，抑制海马神经元凋亡，从而减轻大鼠脑组织I/R 所引起的认知功能障碍［53］。同时，该研究还检测到线粒体自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）可加重海马神经元凋亡，这进一步验证了以上结论。但是，Feng 等［54］的研究显示，PINK1/parkin 介导的线粒体自噬通过募集激活的Drp1 到受损的线粒体，加剧大鼠大脑I/R 损伤，而注射3-MA 或Mdivi-1 能减轻神经元凋亡。因此，在缺血性脑卒中发生后，线粒体自噬不足或过度都可能引起海马神经元凋亡，并且适度的线粒体自噬可以保护神经元，在未来应更深入地研究线粒体自噬在PSCI 中的作用，寻求能够适度调控线粒体自噬的治疗方案。

2.4 线粒体生物发生参与PSCI 的发展 当机体发生脑卒中时，细胞内ROS大量堆积，线粒体内的蛋白质和DNA 受损，随后线粒体开始自噬以清除受损线粒体，而神经元内线粒体的减少激活了线粒体的生物发生，这为细胞提供大量新生线粒体，维持细胞能量代谢的平衡。但是，因为在脑卒中发病过程中线粒体可能受损严重，所以它不能有效地启动生物发生过程，这会造成因线粒体供能不足而使神经元死亡的现象，并且会进一步加重脑组织的损伤［55-56］。PGC-1α 是线粒体生物发生的“激发器”，近些年，有研究证实了在I/R 损伤的早期TFAM 和PGC-1α 的表达增加，但是随着疾病的进展这2 种分子在神经元内的表达逐渐减弱，并且神经元会大量凋亡［57］。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3（C1q/tumor necrosis factor-related protein 3，CTRP3）常表达在脂肪细胞、肌细胞、神经元等多种细胞中，参与细胞增殖、凋亡、炎症反应和体内代谢的调节。一项体外细胞实验显示，CTRP3过表达可以通过上调AMP 活化蛋白激酶和沉默信息调节因子1 蛋白表达及磷酸化PGC-1α，增加 NRF-1、NRF-2 和 TFAM 的蛋白含量，促进 OGD海马神经元线粒体生物发生，进而减少海马神经元的凋亡［58］。随后，通过细胞转染抑制PGC-1α的表达，结果显示CTRP3的过表达不能保护线粒体，这进一步证实了以上结论。单羧酸转运蛋白2（monocarboxylic acid transporter 2，MCT2）在激活PGC-1α和脑能量代谢中起着重要作用，一项在体实验对MCAO大鼠的蛋白进行检测，结果显示海马神经元中MCT2、PGC-1α 和 TFAM 的蛋白水平下降，大鼠出现认知功能障碍［59］。然而，当 MCT2 过表达时，线粒体生物发生增强并且海马神经元功能恢复。上述研究显示，线粒体生物发生受损是导致脑卒中后出现认知障碍的重要机制之一，增加新生线粒体数量可能成为治疗PSCI的一种新方式。

3 调控线粒体质量控制体系可缓解PSCI

随着线粒体研究的逐渐深入，许多学者认为治疗脑血管疾病和认知功能障碍的关键在于调控线粒体质量控制体系，见表1。丁基苯酞（dl-3-n-butylphthalide，NBP）不但可以治疗缺血性脑卒中，而且还能改善慢性脑灌注不足（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）引起的认知功能障碍。一项体外实验使用NBP 干预OGD 神经元，观察到NBP 能够上调Mfn1和Mfn2蛋白，下调Drp1和Fis1蛋白，减少神经元缺血缺氧所引起的死亡［60-61］。随后，有动物实验表明，辣椒素可以增加CCH 大鼠体内的Mfn2 水平、上调海马线粒体-内质网结构偶联（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAMs）的表达，进而改善受损大鼠的认知功能［62］。另外，Klimova 等［63］认为烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）可刺激烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）产生，抑制脑缺血后海马神经元线粒体蛋白的乙酰化、ROS 的生成及线粒体的碎片化。同时，他们还认为抗氧化剂mitoquinone（MitoQ）可降低缺血后海马区线粒体ROS含量，进而减轻小鼠学习记忆障碍。黄芪甲苷（astragaloside IV，AST-IV）是黄芪的主要生物活性成分，在中医中被广泛用于PSCI的治疗。Xue等［64］观察到，AST-IV通过激活蛋白激酶A/cAMP 反应元件结合蛋白信号通路降低OGD神经元中线粒体的膜电位水平及ROS和ATP含量，并减少神经元的凋亡数量。这说明AST-IV可能通过保护海马神经元线粒体活性而缓解PSCI。近期大量研究证实，槲皮素能够抑制神经元的凋亡，减缓脑卒中的发生发展。例如，槲皮素可上调I/R 大鼠PINK1、parkin和LC3-II通路蛋白表达，促进线粒体自噬，维持海马神经元内线粒体的正常形态［65］。此外，参麻益智方通过提高线粒体关键蛋白的表达，促进线粒体的新生，维持线粒体结构和功能的完整性，增强机体的抗氧化能力，最终缓解大鼠血管性认知障碍［66］。尽管尚未有研究直接证明通过某种手段治疗PSCI的机制是维持线粒体质量控制体系的平衡，但以上研究从各种角度证实了治疗脑血管疾病引起的认知障碍可通过调控线粒体质量控制来实现。

表1 通过干预线粒体治疗PSCI的潜在靶点Table 1. Potential targets of treatment of PSCI through mitochondrial intervention

4 结语与展望

综上所述，线粒体质量控制体系失衡对脑卒中的发病过程及大脑认知功能损害有重要作用。因此，线粒体质量控制体系的紊乱极有可能出现在PSCI的发病过程中：当机体发生脑卒中，大脑海马神经元发生氧化应激，ROS 大量堆积，破坏线粒体的正常功能；然后，线粒体动力学会出现失衡现象，一方面受损较轻的线粒体将不会与正常线粒体进行融合，另一方面线粒体受损严重的部分也不会与正常部分分裂或线粒体碎片化严重；随后，线粒体自噬不足会导致ROS 和线粒体碎片不能被完全清除，而线粒体自噬过度又可能使自噬系统超负荷；最后，线粒体生物发生受到抑制，新生线粒体减少。这些线粒体分裂、融合、自噬和生物发生的异常都可能破坏线粒体数量和功能，引起海马神经元的供能不足，导致神经元程序性死亡，进而损害机体的认知功能。

现阶段，关于PSCI 的有效治疗较少，需要进一步开展机制研究。线粒体质量控制失衡引起认知障碍的证据在脑卒中发病过程中尤为明显，但是很少有学者将这种机制与治疗PSCI 的方法联系起来。因此，笔者提出以下假说：以线粒体质量控制为靶点，通过各种手段来调控海马神经元内ROS 含量及线粒体融合、分裂、自噬和生物发生的动态平衡，进而改善线粒体的功能状态，防止海马神经元死亡，可能有助于PSCI的治疗。在今后PSCI的防治过程中，该假说仍需进一步探索。