香烟烟雾诱导慢性阻塞性肺疾病模型小鼠气道上皮屏障损伤的机制*

江宇航 ， 梅晓峰 ， 贾利丹 ， 田燕歌 ，2， 赵 鹏 ，2△

（1河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南省中医药防治呼吸病重点实验室，河南 郑州 450046；2河南中医药大学中医药科学院，河南 郑州 450046）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见慢性疾病，主要表现为呼吸困难、咳嗽、咳痰等持续性的呼吸道症状以及不可逆的气流受限，通常与多种因素引起的炎症反应引发的气道或肺泡异常有关［1］。我国40 岁以上人群COPD 患病率约13.7%，近1 亿患者，为我国第3位致死疾病，已成为我国重大公共卫生问题［2-3］。气道上皮细胞间通过闭合蛋白（occludin，OCLN）、闭锁小带蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）等紧密连接蛋白和黏附连接蛋白构成完整的屏障；病原微生物或有害气体如香烟烟雾（cigarette smoke，CS）暴露可以直接诱发炎症反应破坏上皮屏障，如降低ZO-1、OCLN 蛋白表达等。因此，上皮屏障损伤诱发气道病理改变是COPD 发生发展的关键环节［4］。研究表明，COPD 患者肺组织中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和 P38 磷酸化水平升高，上调IL-6 等炎症因子水平，与气道上皮细胞屏障损伤紧密相关［5］。因此，本实验假设CS 可以通过激活EGFR/P38 信号通路损伤COPD 模型小鼠的上皮细胞屏障，由此探讨CS 在COPD 进展中对气道上皮屏障的影响及机制，为探索COPD 发生发展的机制与防治策略提供依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 SPF 级 BALB/c 小鼠 72 只，雄性，体重（20±2）g，6～7 周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为110011200106861568，许可证号SCXK（京）2016-0006。本研究通过河南中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审查批准（伦理审查批号：DWLL202003210）。

1.2 细胞 人气道上皮细胞BEAS-2B 购于上海子实生物有限公司。

1.3 香烟 红旗渠过滤嘴香烟（烤烟型，焦油量10 mg，烟气烟碱量0.8 mg，烟气一氧化碳量12 mg），由河南中烟工业有限责任公司生产。

1.4 试剂 DMEM/F-12 培养液，胎牛血清，1×PBS缓冲液，RIPA 裂解液，BCA 蛋白定量试剂盒，10%SDS-PAGE 凝胶试剂盒，ZO-1、OCLN、p-P38、p-EGFR和GAPDH 单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG Ⅱ抗，TNF-α ELISA Kit 和 IL-6 ELISA Kit 均购自BD。

1.5 仪器 CO2培养箱和CJ-2F 型超净工作台（Thermo）；DP70 型显微镜及显微照相系统（Olympus）；动物肺功能检测系统（FinePointe PFT）；全波长酶标仪（Multiskan GO）；样品破碎系统（TissueLyserⅡ）；高速台式冷冻离心机（D-37520）。

2 方法

2.1 动物模型建立与分组 将72 只SPF 级BALB/c小鼠，随机分为对照（control）组和 CS 组，每组36 只。第1～8 周，CS 组小鼠用CS 熏吸［将小鼠放入熏烟箱，点燃香烟使烟雾浓度达到（30±5）%时进行烟雾熏吸，每次40 min，每天2 次］，control 组小鼠正常饲养不作处理［6］。分别于第4周、第8周和第16周取材。

2.2 香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）制备 取注射器抽取红旗渠香烟烟雾溶解于完全培养液，以全波长酶标仪320 nm测定，并用空白培养基调整其吸光值为2.0～2.2 作为100% CSE 备用。加入细胞前以无菌滤器过滤。

2.3 细胞模型建立与分组 BEAS-2B 细胞培养于DMEM/F-12完全培养液，置于37 ℃、5%CO2培养箱；细胞以每皿1.5×105个接种于35 mm 皿中，待细胞密度达70%～80%左右，将完全培养液换为DMEM/F-12培养液饥饿3～6 h，分为对照组、5%CSE组、10%CSE组和15% CSE 组，分别给予相应浓度CSE 处理6 和24 h后，RIPA裂解液收集细胞蛋白。

2.4 肺功能测定 第0、4、8、12 和16 周采用小动物全身体积描记检测系统检测小鼠潮气量呼气流量（tidal volume，TV）、呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）等指标。

2.5 肺组织病理 采用10%中性甲醛固定肺组织，72 h 后进行石蜡包埋及HE 染色。每张肺组织切片随机截取6 个肺泡视野图片，在图片中央画出“十”字，计算每个视野的肺泡数（Na）和肺泡隔膜数（Ns），测量长度（L）和面积（S），计算公式如下：肺泡平均截距（mean linear intercept，MLI）=L/Ns，平均肺泡数（mean alveolar number，MAN）=Na/S［7］。

2.6 炎症因子水平检测 将小鼠右肺分离后，取50 mg 肺组织破碎匀浆取上清，根据ELISA 试剂盒说明书检测小鼠肺组织中IL-6和TNF-α表达水平。

2.7 Western blot 收集第8周小鼠肺组织匀浆及细胞裂解液上清，BCA 法测定蛋白浓度，再用Western blot法测定p-EGFR、p-P38、OCLN和ZO-1蛋白水平。

2.8 免疫荧光 将第4、8、16 周小鼠肺组织切片，脱蜡后，在0.2% Triton X-100 中透化后封闭2 h，然后用1∶1 000稀释的抗ZO-1和OCLN 抗体4℃孵育过夜；PBS 洗涤后，用荧光Ⅱ抗避光室温孵育1 h，用DAPI染核15 min，封片后在荧光显微镜下观察。

3 统计学处理

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。动物数据比较采用t检验；细胞数据组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD-t法，方差不齐者采用Dunnett's T3 法。数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺功能

第 0～4 周，control 组与 CS 组小鼠 TV 和 PEF 无显著差异；第 8～16 周，与 control 组相比，CS 组小鼠 TV和PEF均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），见图1。

Figure 1. The lung function（TV and PEF）of mice in each group. Mean±SEM. n=8～10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图1 不同时间点各组小鼠肺功能变化

2 肺组织病理

肺组织HE 染色显示，control 组小鼠肺组织结构正常，未见病理改变；造模8 周后，CS 组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润、肺泡腔扩张、肺泡壁断裂融合及气管壁增厚等病理变化。与control组比较，第8和16 周CS 组小鼠MAN 显著降低，MLI 显著升高（P＜0.05或P＜0.01），见图2。

3 肺组织IL-6和TNF-α水平

ELISA法检测肺组织IL-6和TNF-α结果表明，与control 组比较，第 4 周 CS 组 IL-6 和 TNF-α 表达升高，第 8 和 16 周 CS 组 IL-6 和 TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），见图3。

4 气道上皮细胞ZO-1和OCLN的表达

免疫荧光法检测结果显示，CS 组小鼠肺组织气道上皮细胞间连接蛋白ZO-1 和OCLN 表达在第4、8周逐渐降低，并持续至16 周，见图4。Western blot 结果显示，与 control 组比较，第 8 周 CS 组中 ZO-1 和OCLN 的表达显著降低（P＜0.01），见图5A。此外，CSE 可显著降低人支气管上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和OCLN的表达（P＜0.01），见图5B。

5 香烟烟雾诱导EGFR/P38信号活化作用

如图 6 所示，CS 暴露 8 周后，与 control 组小鼠比较，CS 组小鼠肺组织中EGFR 和P38 的磷酸化水平显著升高（P＜0.01）；CSE 诱导BEAS-2B 细胞 6 h 后，可见EGFR 和P38 的磷酸化水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

讨 论

近年来COPD 的患病率和病死率不断上升，吸烟、感染以及污染都是诱发其发病的主要因素，90%的临床患者是吸烟者或具有吸烟史［8-9］。香烟烟雾可以直接损伤气道上皮组织，募集炎症细胞诱发持续的炎症反应与组织损伤，破坏气道上皮屏障功能［10］。本研究旨在探讨在COPD 模型小鼠中CS对气道上皮屏障作用及潜在机制。

持续性气流受限为COPD 主要的临床症状，所以肺功能的改变可作为模型制备的重要评价标准。TV 可以反映肺容积的变化，PEF 可以反映气道整体传导性变化，再结合肺组织病理变化可以判断COPD模型是否成功。本研究采用香烟烟雾熏吸诱导COPD 模型小鼠。香烟烟雾暴露8 周后，CS 组小鼠TV 和PEF 显著下降，肺组织中炎症细胞浸润、肺泡与小气道的损伤明显，肺组织中IL-6 和TNF-α 表达升高，并持续到16 周。这些结果表明香烟烟雾熏吸8 周可成功建立COPD 模型小鼠，且该模型病变稳定，适宜于后续病理机制研究。

Figure 2. Pathological changes of mouse lung tissues at each time point. A：histopathological changes of lung tissues of each group（HE staining，scale bar=50 μm）；B：mean alveolar number（MAN）and mean linear intercept（MLI）were detected.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图2 不同时间点小鼠肺组织病理

Figure 3. The expression levels of inflammatory cytokines（IL-6 and TNF-α）in lung tissues. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 小鼠肺组织炎症因子表达变化

Figure 4. The protein levels of ZO-1（A）and OCLN（B）in lung of mice（scale bar=50 μm）.图4 小鼠肺组织ZO-1和OCLN蛋白表达

气道上皮屏障结构能够抵御空气过敏原、污染物和病原体等有害物质入侵，且可以及时启动免疫应答清除有害物质［11］。气道上皮屏障细胞间连接方式包括紧密连接（tight junctions，TJs）和黏附连接（adherens junctions，AJs）。TJs 位于细胞顶端，限制上皮细胞的通透性［12］，由跨膜蛋白、OCLN 和 ZO-1 等组成。有学者观察到COPD 患者支气管上皮中TJs相关蛋白ZO-1 和OCLN 表达降低，上皮屏障功能减弱，而糖皮质激素可上调上皮屏障功能基因表达［13-16］；香烟烟雾可诱导人支气管上皮细胞TJs 相关蛋白水平表达下调，破坏紧密连接的完整性［5］，而布地奈德可上调 ZO-1 表达［17］。本研究采用 CS 给予小鼠暴露后，第4、8、16 周小鼠肺组织气道上皮细胞间连接的相关蛋白ZO-1 和OCLN 表达逐渐降低，证明在小鼠COPD 发展过程中香烟烟雾可以破坏肺组织气道上皮细胞间的TJs 造成气道屏障损伤。此外，CSE 可以浓度依赖性诱导气道上皮细胞连接蛋白ZO-1 和OCLN 表达降低。由此表明，CS 可以破坏上皮细胞间连接损伤气道上皮细胞屏障。

EGFR 表达于肺支气管和肺泡上皮细胞，调控细胞增殖、创伤修复等生理过程［18-19］。CS可以激活EGFR 从而上调 IL-6 表达破坏上皮屏障完整性［20-21］。临床研究显示，COPD 患者肺组织中p-EGFR 表达显著上升［22］。此外，P38作为MAPK信号通路分子之一，可以将细胞将信号由细胞表面传至细胞核内，上调炎症因子如IL-6和IL-1等表达［23］。有研究证明，P38磷酸化水平升高可导致上皮细胞正常功能受损［24］。本研究显示CS暴露8周建立COPD模型小鼠，且肺组织中EGFR 和P38 的磷酸化水平显著升高。体外研究显示，CSE 诱导气道上皮细胞 6 h 后，EGFR 和 P38 磷酸化水平显著升高。以上结果表明，EGFR/P38 信号通路活化参与了CS诱导小鼠气道上皮屏障损伤。

Figure 5. Expression levels of tight junction proteins in the lung tissues（A）and airway epithelial cells（B）induced by CS and CSE，respectively. The protein levels of ZO-1 and OCLN were detected by Western blot. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图5 香烟烟雾诱导小鼠肺组织和气道上皮细胞的细胞间连接蛋白表达

Figure 6. Expression levels of EGFR/P38 signaling proteins in the lung tissues（A）and airway epithelial cells（B）induced by CS and CSE，respectively. The protein levels of p-EGFR and p-P38 were detected by Western blot. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图6 香烟烟雾诱导小鼠肺组织和气道上皮细胞的EGFR/p38信号蛋白表达

综上所述，CS 诱导小鼠COPD 疾病发生发展与气道屏障损伤有关；其中CS 可以直接诱导气道上皮细胞连接损伤，且与EGFR/P38 信号活化有关。因此，阻抑EGFR/P38 信号活化、保护气道上皮屏障可能是改善COPD的有效途径。