白芷总黄酮超临界CO2萃取工艺优化及体外抑菌、抗氧化活性的研究

杨惠舒，汤凯璇，秦焕宇，徐欣欣，刘馨谣，郑志娟

（山东中医药大学，山东 济南 250355）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 白芷饮片（购于山东中医药大学校医院中药房，批号1904070542）干燥粉碎后过5号药典筛。

1.1.2 试剂 芦丁对照品（批号：202104-210421，南京源植生物科技有限公司）、无水乙醇（批号：20210506，上海国药化学试剂）、浓盐酸、氢氧化钠（批号：20210102，安达实验试剂耗材）、亚硝酸钠、三氯化铝、DPPH、维生素C（VC）。

1.1.3 设备 752自动紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；LDO-101-2电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；qe-300多用型粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；TGL-16A冷冻离心机（青岛正恒试验设备有限公司）；BSA124S电子分析天平（欧莱博仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 白芷总黄酮的提取

1.2.1.1 单因素实验 在预实验的基础上，按照萃取时间（A）2.5 h、萃取温度（B）32℃、萃取压力（C）31 MPa的条件下进行单因素实验，研究不同的因素条件对白芷总黄酮得率影响。

1.2.1.1.1 萃取时间 在基础实验条件的基础上，精确称取5份3 g等量白芷粉末，控制条件：萃取温度32℃、萃取压力31 MPa，探究超声时间为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h对白芷总黄酮得率的影响。

1.2.1.1.2 萃取温度 同上控制萃取时间2.5 h、萃取压力31 MPa的实验条件，探究萃取温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃对白芷总黄酮得率的影响。

感知机算法在线性可分情况下具有较快的训练速度和较高的正确率.其通过寻找超平面区分散射参数曲线.经过多组实验和测试，散射参数曲线经过预处理后具有线性可分的特点，适合作为使用感知机进行二分类.

1.2.1.1.3 萃取压力 同上控制萃取温度32℃、萃取时间2.5 h，探究萃取压力25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa、45 MPa对白芷总黄酮提取率的影响。

1.2.1.2 响应面优化 选取预实验考察所得趋势中对结果影响较为显著的萃取时间、萃取温度及萃取压力3个条件，以白芷总黄酮含量为指标，应用Design-expert软件中Box-Behnken设计方法设计3因素3水平的实验[11]，研究各因素及各因素交互作用对白芷总黄酮含量的影响，并采用二次多项式回归方程进行模型预测，以优化白芷总黄酮提取工艺条件。试验因素水平见表1。

表1 响应面实验因素水平设计表Table 1 Horizontal design table of response surface experimental factors

1.2.2 白芷总黄酮的含量测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成浓度为1.35 mg/mL的对照品储备液。将储备液用60%乙醇溶液稀释得0 mg/mL、0.225 mg/mL、0.45 mg/mL、0.675 mg/mL、0.9 mg/mL、1.125 mg/mL、1.35 mg/mL的对照品溶液[7]，并统一滴加0.30mL5%NaNO2溶液、0.3 mL10%Al（NO3）3溶液、4mL 4%NaOH溶液，在510 nm紫外处测定吸光度[8]。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 10.0 g白芷饮片粉末于超临界CO2萃取釜，经预实验和文献查阅参考[9]，确定条件为固定90%浓度乙醇溶液、20 L/h流量的CO2，设置不同单因素实验的萃取温度、萃取时间和萃取压力进行萃取，得到待测样品溶液[10]。

1.2.2.3 含量测定 将上述方法所得的中药提取液与70%乙醇，按照体积比1:4配比于10 mL的比色管中作为样液。取待测样液和0.9 mg/mL的芦丁对照品（参比液）各1 mL，各份按上节方法处理，测定其吸光度。代入回归方程可得浓度数据，平行测定3次取平均值。运算后得出总黄酮得率[11]。

1.2.3 抗氧化实验

以VC做阳性对照，配制0.03 mg/mL、0.06 mg/mL、0.09 mg/mL、0.1 mg/mL、2 mg/mL、0.15 mg/mL浓度的总黄酮提取液样品，分别与1 mL体积、0.01 mg/mL浓度的DPPH溶液反应，时间以30min为宜，于510 nm紫外处测定吸光度（E），检测总黄酮的DPPH自由基清除率。清除率（D）计算公式如下：

E1：总黄酮样品与DPPH反应液的吸光度，E0：DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 体外抑菌活性实验

取两种菌型，利用纸片法进行总黄酮的体外抑菌活性实验。取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌用接种环于培养基上划线，将浸有不同浓度总黄酮提取液的滤纸片和无菌水滤纸片（空白对照）均匀放于培养基表面[12,13]，将培养基放于恒温培养箱，一段时间后取出观察，并确定总黄酮对不同菌种的MIC值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 萃取时间对白芷总黄酮含量的影响 在萃取温度32℃、萃取压力31 MPa条件下，不同萃取时间对白芷的总黄酮含量的结果，见图1。

图1 萃取时间对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of extraction time on the total flavonoids content

2.1.2 萃取温度对白芷总黄酮含量的影响 在萃取时间2.5 h、萃取压力31 MPa的实验条件，不同萃取温度的总黄酮含量的结果，见图2。

图2 萃取温度对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the total flavonoid content

2.1.3 萃取压力对白芷总黄酮含量的影响 在萃取时间2.5 h、萃取温度32℃的实验条件，不同萃取温度的总黄酮含量的结果，见图3。

图3 萃取压力对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of extraction pressure on the total flavonoids content

2.2 响应面优化设计实验结果

2.2.1 响应面回归模型的方差分析 利用Box-Behnken模型将上述所得数据进行多元线性回归拟合，结果见表2。可得回归方程模型：

表2 白芷总黄酮得率试验设计与结果表Table 2 Test design and result of flavonoid yield of Angelica dahurica

其中各参数分别为：总黄酮得率（Y）萃取时间（A）、萃取温度（B）、萃取压力（C）。对所得的回归模型进行方差分析，由表可见F=19.24，P＜0.001，说明所选取的三因素对总黄酮提取率的影响显著。失拟项p（0.007 1）不显著，决定系数R2=0.961 1，表明拟合度较好，试验方法可靠。此外，对模型进行回归方程系数显著性检验可知：A、C、A2、C2的P＜0.01，说明因素A、因素C及二者的交互项和各自的二项式都具有显著性影响。

2.2.2 响应面图结果与分析 如图4所示，可以根据3D曲面的陡峭程度，判断响应值对各因素的敏感程度：越陡峭越敏感，越平缓则越迟钝。由图可见，C、A曲面陡峭，说明其对萃取率交互作用明显。各因素对响应值的影响的关系为C＞A＞B。

图4 各因素交互响应面结果图Fig.4 Results of the interactive response surface of each factor

2.2.3 提取工艺优化与检验 由模型分析，以A=2.5 h、B=32℃、C=31 MPa为优化提取条件，将所测吸光度数值，带入芦丁标准曲线：E=10.858 c+0.001 6，R2=0.999 9（E：吸光度，c：浓度g/mL），得总黄酮得率最大值（17.81%）。按软件拟合所得的最佳提取条件进一步验证试验，结果中总黄酮得率为17.51%，与理论值之间的相对偏差小于1%，说明该实验结果具有可验证性，此次条件优化具有实际意义，所得最佳工艺切行可靠。

表3 白芷总黄酮得率数学方差分析结果Table 3 Mathematical variance analysis results of flavonoid yield of Angelica dahurica

图5 各因素交互响应面等高线图Fig.5 Contour map of interaction response surface of each factor

2.3 体外抗氧化实验结果

总黄酮清除率见图6，经结果分析，在一定程度上，总黄酮的DPPH抗氧化程度随着质量浓度的增加而增加。白芷总黄酮的DPPH自由基的IC50值为0.063 mg/mL，最大清除率为72%；相比较于阳性对照VC的半数清除率浓度IC50为0.054 mg/mL，最大清除率为85%。由此可见，白芷总黄酮的抗氧化活性良好。

图6 总黄酮DPPH自由基清除率结果Fig.6 DPPH free radical scavenging results of flavonoids

2.4 体外抑菌活性实验结果及分析

由表4可见白芷总黄酮对于两种菌型（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）均有一定的抑制作用。其中大肠杆菌的MIC值为0.5 mg/mL，金黄色葡萄球菌的MIC值为0.25 mg/mL，可以说明较少的总黄酮量就可以达到一定的抑菌效果，白芷总黄酮具有较好的体外抑菌活性。

表4 总黄酮体外抑菌活性结果对照表Table 4 Comparison of antibacterial activity results of flavonoids in vitro

3 结果与讨论

由响应面实验结果及方差分析可知，超临界CO2萃取白芷总黄酮的最适参数为萃取时间2.5 h、萃取温度32℃、萃取压力31 MPa。在此条件下提取的白芷总黄酮含量高达17.81%。温度过高，超声时间过长均会使得总黄酮得率下降。通过验证试验可知，该工艺总黄酮提取率为17.51%，与预测值相近，相对偏差小于1%。相关文献数据表明，该方法与传统的有机溶剂法对比提取率得到提高，且白芷总黄酮各类理化指标均有所改善[14]，可见响应面实验能够较为准确地分析出各因素间的交互作用，该方法用于提取白芷总黄酮合理可行。但单一的超临界CO2萃取技术也存在一定的弊端，其设备造价昂贵、成本高的弊端已成为其普及的巨大阻碍[15]。

白芷总黄酮作为一种天然成分，对人体具有诸多益处，在人类健康方面拥有重要地位。通过DPPH自由基清除抗氧化实验，证明了白芷总黄酮具有良好的抗氧化活性。同时，体外抑菌活性实验结果也表明，总黄酮对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有良好的抑菌活性。总黄酮的抗氧化和抑菌作用，在原有应用的基础上，可以拓展其在医药及医美等其他领域的应用，从而衍生出更具实际价值和意义的产品。