牙本质龋的太赫兹成像研究

李 岩, 柳启航, 黄 葳, 段 涛, 陈朝霞, 何明霞， 熊 宇*

1. 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院口腔科， 重庆 400038

2. 天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室， 天津 300072

3. 天津大学精密仪器与光电子工程学院， 天津 300072

引 言

龋病是一种牙体硬组织在口腔微生物作用下缓慢脱矿并逐渐崩解破坏的疾病， 我国5岁儿童乳牙患龋率为70.9%， 35～44岁成人患龋率高达89.0%， 65～74岁人群根面龋患病率为39.4%[1]。 龋病进展至牙本质即为牙本质龋， 其进展程度及龋损范围与牙髓感染状态及活力密切相关， 并影响临床诊疗决策和实施。 牙本质龋的早期诊断及其病损范围的精确辨识一直是国内外学者关注的重点。

目前， 龋病的临床检测及诊断仍缺乏可靠、 有效的方法[2]。 国际龋病检测与评估系统将临床最常用的视诊、 探诊作为龋病评估的标准[3]， 但其较为主观且过于依赖临床医生经验。 常用放射诊断技术如根尖X线片、 牙合翼片等不仅存在电离辐射危害， 其灵敏度亦较低， 牙体硬组织脱矿常需达40%以上时才能在X线上确切显示病变[4]。 光镜观察常可精确辨识牙本质龋损结构与龋损范围， 但其只能在离体牙磨片上进行， 无法用于临床诊断。

然而， 上述太赫兹检测方法仍然存在成像分辨率低， 龋损边界辨识不清晰等不足， 牙本质龋的高分辨率太赫兹成像以确定牙本质龋损范围的研究尚未见报道。

本文评价不同太赫兹成像方法及光谱参数下的牙本质龋损组织图像及其准确性， 从而为探索精确、 灵敏且无电离辐射危害的早期牙本质龋损临床检测技术提供理论依据。

1 实验部分

1.1 太赫兹时域光谱系统

太赫兹时域光谱系统主要为德国Menlo Systems公司生产的太赫兹时域光谱仪TeraSmart， 搭配二维平移载物台构成， 系统原理图如图1所示。 飞秒激光在被分光镜分为两束光束后， 其中的泵浦光束通过发射器产生太赫兹光， 探测光束经过延迟系统后与透射过样本或样本反射的太赫兹光同时到达探测器， 探测器产生电信号， 经放大器和A/D转换处理后， 获得太赫兹时域光谱信号， 经傅里叶变换可转化为样品的频域光谱。

图1 太赫兹时域光谱系统原理示意图

1.2 样本制备

随机选取因阻生齿龋坏而在陆军军医大学第一附属医院口腔科完整拔除的新鲜第三磨牙15颗， 其中窝沟龋12颗， 平滑面龋3颗， 平均年龄20～35岁。 立刻刮除牙周软组织， 超声波洁牙机清洁后置于去离子水中4 ℃冷藏下备用， 1周内使用。 测试以前环氧树脂包埋离体牙， 低速齿科技工打磨机(401A型， 上海齿科器械厂， 上海)流水冷却下沿牙体长轴纵切成约1 mm薄片， 180， 360， 600， 800， 1 200， 2 000和3 000目水砂纸在流水冷却下打磨成100～500 μm牙磨片， 游标卡尺记录磨片厚度。 去离子水超声清洗5 min×3次。

所有的样本经太赫兹平台及X线影像检测后， 充分干燥置于载玻片上， 中性树脂封片后制成光镜磨片。

1.3 方法

1.3.1 透射模式与反射模式下的太赫兹光谱检测

记录太赫兹时域光谱系统空载时的时域信号作为参考信号。 制备好的离体牙磨片置于室温25 ℃， 湿度35%的环境下2 h[8]以模拟口腔环境。 随后固定于二维平移载物台， 使太赫兹光束(直径1.5 mm)聚焦于样本。 载物支架带动样本移动(步径为0.2 mm)完成扫描探测。

1.3.2 X线影像检测

牙科X射线机(西诺德， HellodentPlusD3507德国)对离体牙磨片垂直投照， 得到离体牙磨片X线图像。 电流7 mA， 电压60 kV， 曝光时间0.03 s。

1.3.3 扫描式光镜检测

使用扫描式光镜(Magscanner， KF-PRO-005-EX中国)在40×倍率下扫描， 得到牙磨片的数字化光镜图像。

1.4 图像拟合与龋损面积评价

反射模式下仅能识别样本大体轮廓， 因此未进行图像拟合与面积计算。 透射模式下， 对样本光谱信号处理并重构生成太赫兹图像。 将太赫兹图像与X线图像、 光镜图像拟合， 观察牙体硬组织形貌特征重叠情况。 由同一名工作3年以上的牙体牙髓病科医师， 使用Image J测量太赫兹图像、 光镜图像中的牙本质龋损区域面积， 每个样本， 每种方法各测量3次取其平均值并记录。

1.5 统计学分析

由于样本牙本质龋损面积波动大， 存在极端值， 本文使用非参数统计方法。 使用SPSS 23.0软件对15个样本太赫兹图像及光镜图像中龋损面积进行配对样本的Wilcoxon符号秩和检验， 检验水准α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 样本的光镜及X线图像

图2A①为样本的数字化光镜图像， 可见样本包含健康牙釉质、 牙本质及牙本质龋。 图2A②为局部牙本质龋损图像， 龋损为“月牙状”黄棕色深染区域， 龋损两侧、 底部可见均质、 透明的条带状透明层。 蓝色曲线描记牙本质龋损范围， 测得该样本平均牙本质龋损面积为： 10.69 mm2。 体视光镜是研究牙本质龋病理结构的常用手段， 可以明确牙本质龋损边界。 扫描式光镜可获得样本的数字化图像， 从而在数字化图像中测量、 编辑， 并可以和太赫兹图像进行数字化拟合。 透明层被认为是与健康牙本质临界的龋病最深层， 此层无致龋菌， 临床去龋时保留完整的透明层有重要的意义， 是临床去龋的病理止点[9]。

图3A①为样本的X线图像， 可见样本整体轮廓与光镜对应。 牙合面“月牙”状密度减低影为牙本质龋损。 图3A②为局部牙本质龋损图像， 可见牙本质龋损的低密度影像与健康牙本质高密度影像界限较模糊， 不易区分。

2.2 样本的反射式太赫兹图像

图4A①是利用时域信号最小值对应的时间成像， 图像上牙釉质、 牙本质及牙本质龋未能表现出形态上的区分， 仅能显示出样本的轮廓， 其对应的灰度图4A②表现出相似的特征。 图4B①是利用频域1 THz相位差进行成像， 其效果相较于图4A①而言更佳， 其对应的灰度图4B②牙本质龋相对于其他部分颜色要深， 形态上有一定的区分度。 图4C①是利用频域1 THz功率进行成像， 该图像上仅能显示出样本的轮廓， 其对应的灰度图效果相似。

图2 A①样本光镜图像； A②光镜下牙本质龋损轮廓

图3 A①样本X线图像； A②X线下牙本质龋损轮廓

图4(A—C)是采用90°垂直入射的反射系统获得的图像， 仅能呈现样本轮廓， 不能有效区分牙釉质、 牙本质及牙本质龋， 这可能与反射信号较弱， 容易受到样品厚度、 表面平整度[10]以及系统噪声等影响。

2.3 离体牙磨片的透射式太赫兹图像

图5A①是利用时域信号最小值对应的时间成像， 可见牙釉质区域为0～60色阶染色的深蓝色区域， 牙本质为70～110色阶染色的淡蓝色区域， 牙合面140～170色阶染色的绿色、 黄色及橙色区域为一“月牙”状区域。 图5A②是对应灰度图， 龋损区域表现为浅灰色染色， 裸眼视觉效果较X线图像对比度更佳， 对龋损的显示灵敏度高， 分辨率相对较差。 蓝色曲线为牙本质龋损范围， 测量该样本牙本质龋损平均面积为： 8.11 mm2。

图5B①是利用频域1.4THz下相位差进行成像， 表现出与图5A①相似的形态特征， 龋损区域是50～110色阶染色的淡蓝色区域。 裸眼视觉效果较图5A①相似。 图5B②是对应的灰度图， 龋损区域显示为深灰色染色， 裸眼视觉对比度较X线及图5A①相似， 灵敏度较X线高， 分辨率相对较差。 图5C①是透射模式频域1.4 THz的功率成像， 牙釉质、 牙本质及牙本质龋并未表现出形态上的区分， 仅能显示样本轮廓， 对应灰度图5C②表现出相似的特征。

由于太赫兹的宽带特性， 使得太赫兹光谱信息十分丰富， 透射模式下可以使用： 电场强度、 飞行时间、 相位差、 折射率及吸收系数等参数成像[11]。 本文仅列举了成像效果较好的三种方式。 其中时域最小值对应的时间成像效果最佳。

2.4 样本的光镜、 X线及透射式太赫兹图像拟合及龋损面积评价

图6为样本光镜、 X线及透射式太赫兹成像重叠图， 可见三种成像方式下样本形貌特征基本重叠一致， X线与光镜图像牙釉质及牙本质重叠较好。 太赫兹与光镜图像牙本质龋损重叠较好。

图4 A① 反射模式时域最小值对应的时间成像； A②： 反射模式时域最小值对应的时间成像灰度图； B① 反射模式频域1 THz相位差成像； B② 反射模式频域1 THz相位差成像灰度图； C① 反射模式频域1 THz的功率成像； C② 反射模式频域1 THz的功率成像灰度图

图5 A① 透射模式时域最小值对应的时间成像； A② 透射模式时域最小值对应的时间成像灰度图； B① 透射模式频域1.4 THz相位差成像； B② 透射模式频域1.4 THz相位差成像灰度图； C① 透射模式频域1.4 THz的功率成像； C② 透射模式频域1.4 THz的功率成像灰度图

图6 样本光镜、 X线及透射式太赫兹成像重叠图

表1 太赫兹图像与光镜图像中龋损面积(mm2)比较

由于样本牙本质龋损面积波动大， 存在极端值， 本文采用非参数统计方法。 使用配对样本Wilcoxon符号秩和检验统计方法对15个样本扫描式光镜方法下测得的龋损面积与太赫兹时域最小值对应的时间图像中测得的龋损面积进行检验， 结果p>0.05， 尚不能拒绝H0， 即尚不能认为扫描式光镜测量牙本质龋损面积的方法与太赫兹测量龋损面积的方法有差别。 两种方法测得的龋损面积差异主要来源于系统误差。

因此， 认为可以使用太赫兹时域最小值对应的时间图像鉴别牙釉质、 牙本质及牙本质龋， 并且能获得牙本质龋损大小和范围信息， 为指导临床精确、 微创去龋提供形态学依据。

本研究不足之处在于： (1)本文成像分辨率仍显不足， 使得龋损部分的识别存在一定误差。 有研究表明， 近场太赫兹技术[12]利用近场探针作为信号接收器可实现≤20 μm， 甚至10 nm级别的空间分辨率。 故太赫兹技术在龋病成像方面仍有巨大潜力； (2)本研究中反射式平台采用更接近临床的垂直投照方式且未使用石英窗辅助固定样本， 故成像效果未达到预期， 有待进一步研究。

3 结 论

利用太赫兹光谱成像技术对离体牙磨片扫描数据进行二维重构， 获得了不同参数的太赫兹反射和透射图像并与光镜及X线图像拟合、 对比。 结果表明透射情况下时域信号最小值对应的时间成像在区分牙釉质， 牙本质和牙本质龋方面具有最佳效果并且与扫描式光镜图像重叠一致， 其图像测得龋损面积与光镜测得的龋损面积尚不能认为有统计学差异(p>0.05)， 我们认为太赫兹时域最小值对应的时间图像可以获得牙本质龋损范围、 大小等信息为临床数字化、 微创去龋提供形态学依据。

太赫兹技术因为其： (1)无电离辐射； (2)无损可在体检测； (3)对龋病高灵敏度的特性作为新的龋病辅助检查手段有巨大应用潜力， 但如何获得三维空间信息及高分辨率数字化图像， 仍有待进一步研究。